Gasdermin A3基因在小鼠皮膚上皮中對(duì)Krt6b和Frizzled4表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、皮膚是由表皮，真皮組成。皮膚與其附屬器官（如毛囊、皮脂腺和汗腺）一起起到保護(hù)機(jī)體免受外界損傷、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡以及維持體溫的作用。毛囊是皮膚的附屬器官之一，毛囊形態(tài)建成開始于胚胎期12.5天(E12.5)，待小鼠出生后，毛囊會(huì)經(jīng)歷生長(zhǎng)期(anagen)，退化期(catagen)和靜止期(telogen)的周期性循環(huán)。多種信號(hào)通路及各種因子尤其是分化相關(guān)因子參與毛囊周期的調(diào)控，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常均會(huì)影響毛囊周期的正常循環(huán)。
　　角質(zhì)

2、蛋白是重要的蛋白家族，它是皮膚，毛發(fā)，指甲的重要組成成分。Krt6b蛋白是角蛋白家族中的一員，屬于二型角蛋白，該蛋白是哺乳動(dòng)物表皮角質(zhì)形成細(xì)胞成熟分化過程中十分重要的分子，參與角質(zhì)形成層的形成，對(duì)小鼠及其他哺乳動(dòng)物皮膚及內(nèi)部器官起到保護(hù)作用。
　　GsderminA3（Gsdma3）是GSDM家族成員之一，位于小鼠第11號(hào)染色體，該基因突變后小鼠表皮增厚，毛囊發(fā)育異常。成年鼠表皮發(fā)現(xiàn)顆粒狀棘突，毛發(fā)脫落，皮色發(fā)灰白色。前期的研究發(fā)

3、現(xiàn)Gsdma3基因突變鼠表皮細(xì)胞數(shù)量增多，表皮增厚，角質(zhì)層增厚明顯以及毛囊靜止期延長(zhǎng)等特點(diǎn)。這些都與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖分化相關(guān)。提示Gsdma3基因可能與Krt6b有著相關(guān)關(guān)系。
　　Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)皮膚上皮細(xì)胞的增殖分化起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，之前的研究發(fā)現(xiàn)Gsdma3基因突變后，Wnt/β-catenin信號(hào)通路核心分子β-catenin表達(dá)量升高，提示Gsdma3基因與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有

4、著相關(guān)關(guān)系。Frizzled4是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的受體之一，有報(bào)道指出，F(xiàn)rizzled4在毛囊周期進(jìn)程中的表達(dá)具有時(shí)空異性，可能參與了毛囊周期的調(diào)節(jié)。除此之外，曾有報(bào)道指出，Krt6b受到Wnt/β-catenin信號(hào)通路Frizzled的調(diào)節(jié)，因此Gsdma3基因可能通過Frizzled4相關(guān)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路來調(diào)節(jié)Krt6b的表達(dá)。
　　目的:
　　1.通過分析Gsdma3基因突變和

5、過表達(dá)時(shí)，小鼠背部皮膚上皮細(xì)胞中Krt6b和Frizzled4表達(dá)的情況，探明Gsdma3基因?qū)π∈笃つw上皮細(xì)胞中Krt6b和Frizzled4表達(dá)的影響。
　　2.通過抑制小鼠背皮皮膚中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路觀察Krt6b的表達(dá)情況，對(duì)Gsdma3基因調(diào)控Krt6b基因表達(dá)的機(jī)制加以初步探討。
　　方法:
　　1、 Gsdma3基因?qū)rt6b表達(dá)影響的研究
　　通過利用野生型鼠（WT小鼠），Gs

6、dma3基因突變鼠（AE鼠）及Gsdma3基因表達(dá)病毒等材料，應(yīng)用病毒感染、免疫熒光、RT-PCR、Q-PCR、WB等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，在野生型鼠（WT鼠）和Gsdma3基因突變鼠（AE鼠）對(duì)比實(shí)驗(yàn)、Gsdma3基因突變鼠（AE鼠）回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)及野生型鼠（WT鼠）過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，分析在體小鼠皮膚上皮細(xì)胞中，Gsdma3基因?qū)rt6b表達(dá)影響的情況，從而分析Gsdma3與Krt6b的相關(guān)關(guān)系。
　　2、 Gsdma3基因?qū)rizzled4表

7、達(dá)影響的研究
　　通過利用野生型鼠（WT小鼠），Gsdma3基因突變鼠（AE鼠），體外培養(yǎng)小鼠皮膚上皮細(xì)胞（JB6細(xì)胞）及Gsdma3基因表達(dá)病毒等材料，應(yīng)用病毒感染、免疫熒光、RT-PCR、Q-PCR、WB等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，從在體水和離體水平分別分析Gsdma3基因?qū)rizzled4表達(dá)情況的影響，同時(shí)得出Gsdma3基因與Frizzled4的相關(guān)關(guān)系。
　　3、 Gsdma3調(diào)節(jié)Krt6b機(jī)制的初步探明
　　通過利

8、用野生型鼠（WT小鼠），Gsdma3基因突變鼠（AE鼠）及Gsdma3基因表達(dá)病毒等材料，借助病毒感染、免疫熒光、Q-PCR、WB等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，從在體水平上通過Gsdma3基因回補(bǔ)和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)以及Gsdma3基因突變鼠(AE) Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑注射實(shí)驗(yàn)，分析Krt6b和Frizzled4表達(dá)的變化，從而初步探明Gsdma3調(diào)節(jié)Krt6b的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、從野生型鼠和Gsdma3基因突變鼠

9、毛囊周期各個(gè)時(shí)相點(diǎn)出發(fā)，利用免疫熒光、RT-PCR、Q-PCR及WB的技術(shù)手段，其結(jié)果顯示，Gsdma3基因突變鼠皮膚上皮細(xì)胞中Krt6b的表達(dá)上調(diào);Gsdma3基因突變鼠回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Krt6b的表達(dá)下調(diào);野生型鼠拔毛模型過表達(dá)Gsdma3基因，利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Krt6b的表達(dá)也下調(diào)。
　　2、從野生型鼠和Gsdma3基因突變鼠毛囊周期各個(gè)時(shí)相點(diǎn)出發(fā)，采用免疫熒光、RT-PCR、Q

10、-PCR及WB的技術(shù)手段，檢測(cè)結(jié)果表明，Gsdma3基因突變鼠皮膚上皮細(xì)胞中Frizzled4的表達(dá)上調(diào);
　　利用培養(yǎng)的小鼠皮膚上皮細(xì)胞過表達(dá)Gsdma3基因，通過免疫熒光、RT-PCR、Q-PCR及WB的技術(shù)手段，檢測(cè)Frizzled4表達(dá)情況，其結(jié)果顯示，Gsdma3基因過表達(dá)后，F(xiàn)rizzled4表達(dá)下調(diào)。
　　3、在Gsdma3基因突變鼠回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)及野生型鼠拔毛模型Gsdma3過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，利用RT-PCR、Q-PC

11、R及WB的技術(shù)手段檢測(cè)Krt6b和Frizzled4表達(dá)情況，其結(jié)果顯不Frizzled4和Krt6b的表達(dá)量均發(fā)生下調(diào)。Gsdma3基因突變鼠背部皮膚注射Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑，利用免疫熒光手段檢測(cè)，其結(jié)果顯示Frizzled4和Krt6b的表達(dá)量均下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1、在小鼠皮膚上皮細(xì)胞中，Gsdma3基因可以抑制Krt6b基因的表達(dá)。
　　2、在小鼠皮膚上皮細(xì)胞中，Gsdma3基因可以抑制