基于ea4基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)的家蠶滯育生物鐘蛋白質(zhì)作用機(jī)理研究.pdf

1、家蠶是卵滯育性鱗翅目模式昆蟲(chóng)。滯育誘導(dǎo)并非滯育當(dāng)時(shí)的環(huán)境條件，而是親代卵孵化期的溫度、光節(jié)律等環(huán)境因子，而親代蛹期雌性咽下神經(jīng)節(jié)(SG)分泌的滯育激素(DH)水平和產(chǎn)卵后溫度，是確定子代卵滯育性的直接因素。家蠶滯育卵中存在一種與能量利用有關(guān)的酯酶特殊成分(EA4)，其酯酶瞬時(shí)活性(ATPase)有依賴低溫和鹽酸刺激等環(huán)境活化刺激因子、出現(xiàn)蛋白空間結(jié)構(gòu)變化的特性，被稱為時(shí)間間隔測(cè)定酶(TIME)。蛋白質(zhì)生物測(cè)時(shí)是在家蠶首先發(fā)現(xiàn)的一種生物測(cè)

2、時(shí)方式。為了解家蠶卵EA4的滯育生物鐘調(diào)控機(jī)制，本文以家蠶C108品種為材料，克隆了ea4全基因，分析了EA4蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性和分子進(jìn)化，用RT-PCR和胚胎原位雜交等方法調(diào)查了不同滯育性蠶卵及其親代幼蟲(chóng)至成蟲(chóng)不同組織的ea4基因表達(dá)譜。 EA4蛋白質(zhì)在家蠶卵中具有穩(wěn)定的超氧化物歧化酶(SOD)活性，大鼠過(guò)氧化氫酶基因(cat)屬于概日節(jié)律鐘基因clock的一個(gè)鐘控基因。為了解家蠶滯育過(guò)程中cat基因的表達(dá)特征，調(diào)查了家蠶sod

3、、cat以及與家蠶滯育卵特征性能量代謝相關(guān)的山梨醇脫氫酶基因(sdh)的表達(dá)。 在本實(shí)驗(yàn)室獲得的ea4.基因ORF序列(NCBI：DQ086424)和全長(zhǎng)cDNA序列(NCBI:EF121773)基礎(chǔ)上，本文克隆、拼接完成了ea4基因的3個(gè)內(nèi)含子，獲得了ea4全基因序列(NCBI：EF121772)。ea4基因全長(zhǎng)10 265 bp，有4個(gè)外顯子(23 bp、69 bp、204 bp和309 bp)、3個(gè)內(nèi)含子(4 889 bp

4、、3 521 bp和1 250 bp)，內(nèi)含子與外顯子之間的連接符合GT-AG法則。 蛋白質(zhì)同源性分析表明，家蠶EA4不具備羧酸酯酶絲氨酸活性核心結(jié)構(gòu)域，而具有Cu／Zn-SOD的核心結(jié)構(gòu)域，與小鼠、牛、斑馬魚(yú)等Cu／Zn-SOD家族成員同源性較高(48％-50％)。分子進(jìn)化分析表明，家蠶EA4與小鼠、斑馬魚(yú)、線蟲(chóng)和果蠅等物種，甚至家蠶的Cu／Zn-SOD家族蛋白的進(jìn)化距離都較遠(yuǎn)，而與酯酶較近。推測(cè)家蠶EA4蛋白是起源于Cu／Z

5、n-SOD家族，正向酯酶家族進(jìn)化的一種新型酯酶，也是其具有穩(wěn)定的SOD活性和瞬時(shí)酯酶生物鐘活性的雙重酶活性現(xiàn)象的原因。 RT-PCR．和胚胎原位雜交方法研究表明，家蠶親代卵在不同溫度、光節(jié)律等滯育性誘導(dǎo)條件下，孵化后幼蟲(chóng)至成蟲(chóng)期ea4基因的轉(zhuǎn)錄水平不存在發(fā)育時(shí)期的特異性；在蠶卵形成的5齡幼蟲(chóng)期，生殖腺和脂肪體，以及中腸、血液和絲腺中都有ea4基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的組織特異性。子代處女蛾卵、產(chǎn)卵后0.5 h卵等合子未形成的滯育性卵

6、中，有大量的母源ea4 mRNA；產(chǎn)卵后24 h滯育性卵中有較多的ea4mRNA，此時(shí)用鹽酸活化處理，此后的胚胎活化和發(fā)育過(guò)程中，ea4基因一直維持高水平的轉(zhuǎn)錄活性。家蠶EA4由幼蟲(chóng)至成蟲(chóng)期母體非特異性合成后儲(chǔ)存于卵。家蠶TIME-EA4的調(diào)控不依賴于日節(jié)律。 蠶卵不同滯育性及不同活化環(huán)境與家蠶sod、cat和ea4基因表達(dá)的關(guān)系研究表明，雖然家蠶親代卵孵化溫度和光節(jié)律是誘導(dǎo)次代卵滯育的條件，但孵化后幼蟲(chóng)至成蟲(chóng)期sod、cat和

7、ea4基因的表達(dá)，不同誘導(dǎo)條件之間沒(méi)有明顯的時(shí)空特異性，也未出現(xiàn)明顯的節(jié)律變化。孵化溫度和光節(jié)律對(duì)家蠶滯育性的誘導(dǎo)作用可能沒(méi)有通過(guò)sod、cat和ea4基因調(diào)控，或者不在幼蟲(chóng)至成蟲(chóng)期、或者次代卵期作用，cat基因在家蠶中是否為概日節(jié)律相關(guān)基因有待于進(jìn)一步調(diào)查親代卵期的表達(dá)情況。 雖然鹽酸處理后的活化家蠶卵與非滯育卵一樣，幾乎不發(fā)生糖原轉(zhuǎn)變成山梨醇和甘油的反應(yīng)，但與非滯育卵中sdh基因沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性不同，鹽酸活化卵與滯育卵一樣，有較