PRRSV重組NSP7蛋白ELISA檢測方法的建立.pdf

1、目前,豬繁殖與呼吸綜合征依然是世界養(yǎng)豬業(yè)的一大難題。豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因組長約15KB,為單正鏈RNA病毒,它含8個開放閱讀框,編碼nsp7蛋白的基因是ORF1,該基因位于基因組的5’端。目前的研究表明NSP7蛋白是一個可用于檢測PRRSV血清抗體的理想蛋白,其具備以下幾個特征:NSP7蛋白以可溶性蛋白的方式進行表達,利于蛋白的表達與純化。在檢測分析大量樣本時,能夠提供足夠的抗原;NSP7蛋白在同一基因型中有很高的同源性;PRR

2、SV感染后機體內(nèi)產(chǎn)生的抗nsp7抗體的水平很高,可持續(xù)到202天以后。
　　 設計引物,利用RT-PCR的方法從PRRSV BJ-4毒株中擴增得到nsp7基因,將擴增得到的產(chǎn)物連接至表達載體pET28a。將重組質(zhì)粒pET28a-nsp7轉化至BL21(DE3)細菌中,鑒定并測序。進行IPTG誘導表達后,表達結果用SDS-PAGE分析。結果表明成功表達了分子量大小約為33 Kda的重組蛋白。表達蛋白用Ni-NTA樹脂進行純化,We

3、stern blot分析,表明重組蛋白具有良好的抗原性。
　　 以重組nsp7蛋白為檢測抗原,建立了檢測PRRSV抗體的ELISA試劑盒。對試劑盒進行了符合研究,比較NSP7-ELISA和IDEXX試劑盒的檢測結果,二者的陽性符合率為87.59％,陰性符合率為76%,重復率為86.9%,表明NSP7-ELISA有很高的敏感性和特異性。
　　 本實驗成功構建了pET28a-nsp7原核表達載體,并利用大腸桿菌表達系統(tǒng)使目的