Cry1Ac蛋白ELISA檢測(cè)體系的建立.pdf

1、Bt基因是目前轉(zhuǎn)基因食品中使用最廣泛且最有效的一種殺蟲(chóng)基因，并且被廣泛應(yīng)用于基因工程中。目前所發(fā)現(xiàn)的Bt基因有130多種，而且新的Bt基因還在不斷的被發(fā)現(xiàn)和鑒定。Bt基因主要包括晶體蛋白家族基因(Cry)和細(xì)胞溶解蛋白基因(Cyt)。在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因食品研究、開(kāi)發(fā)和商業(yè)化的同時(shí)，建立恰當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)轉(zhuǎn)基因食品中轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行快速鑒定與檢測(cè)，能夠促進(jìn)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理，保障人和動(dòng)物以及微生物的安全，同時(shí)能夠保護(hù)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)

2、的進(jìn)一步研究。本文以目前研究最多的抗蟲(chóng)Cry1Ac基因表達(dá)的Cry1Ac蛋白為檢測(cè)目標(biāo)，在提取獲得高純度抗原后制備高度特異性的多克隆抗體、單克隆抗體和HRP酶標(biāo)抗體的基礎(chǔ)上，比較了三種ELISA方法的靈敏度和線性檢測(cè)范圍，初步建立起了能夠快速檢測(cè)Cry1Ac蛋白的ELISA檢測(cè)試劑盒。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.Cry1Ac蛋白純度和濃度分析
　　 通過(guò)SDS-PAGE對(duì)抗原蛋白Cry1Ac的純度分析結(jié)果表明，所獲得的

3、抗原蛋白純度高，分子量在66.4KDa左右，達(dá)到了免疫所需要的純度與分子量標(biāo)準(zhǔn)；采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度的結(jié)果表明，Cry1Ac蛋白濃度為1.31mg/mL，達(dá)到了免疫所需的抗原濃度要求。
　　 2.多抗血清純化及多克隆抗體制備
　　 將Cry1Ac蛋白與等量弗氏完全佐劑混合后采用背部皮下多點(diǎn)注射(免疫兩只兔子編號(hào)3359、3360)，四次免疫后，3360號(hào)兔子血清效價(jià)高于10000，說(shuō)明3360號(hào)兔子血清對(duì)免疫抗原

4、具有良好的親和性，且其免疫效果明顯較3359號(hào)兔子好，因此對(duì)3360號(hào)兔子在進(jìn)行加強(qiáng)免疫之后取全血、并通過(guò)Sepharose CL-4BProtein A柱對(duì)該兔子的多抗進(jìn)行分離純化。利用SDS-PAGE技術(shù)對(duì)純化后的多克隆抗體進(jìn)行純度分析的結(jié)果表明，分離純化后的多克隆抗體具有極高純度(>90％)，幾乎沒(méi)有其他雜蛋白。
　　 3.雜交瘤細(xì)胞篩選及單克隆抗體制備
　　 進(jìn)一步通過(guò)免疫三只兔子(編號(hào)82、83、84)制備兔單

5、克隆抗體的結(jié)果表明：所選擇的編號(hào)為84號(hào)的免疫效果最好。取該編號(hào)兔的脾融合17天后，共篩選出92個(gè)陽(yáng)性多克隆。然后將這92個(gè)陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)一周，篩選出陽(yáng)性克隆子33個(gè)和雙陽(yáng)性克隆子14個(gè)，其中三個(gè)克隆子(編號(hào)zju-11-18，zju-11-71，zju-11-91)用于質(zhì)粒重組(亞克隆)，三個(gè)克隆子(編號(hào)zju-11-41，zju-11-47，zju-11-50)作為重組備份，八個(gè)克隆子(編號(hào)zju-11-24，zj

6、u-11-28，zju-11-38，zju-11-61，zju-11-65，zju-11-70，zju-11-82，zju-11-84)用于凍存。最終選取一個(gè)sub克隆子(zju-11-71)進(jìn)行單克隆抗體生產(chǎn)。
　　 制備的單克隆抗體經(jīng)Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化后，用PBS溶液溶解，其終濃度為1.78mg/mL。SDS-PAGE純度分析結(jié)果表明，該溶液中沒(méi)有其他雜蛋白。所獲得的單克隆抗體的效價(jià)

7、達(dá)到32000倍，且其對(duì)目標(biāo)抗原的親和常數(shù)為Ka=2.69×109M-1。該抗體與Cry1Ab蛋白無(wú)明顯交叉反應(yīng)，僅當(dāng)Crylc蛋白包被濃度為1000ng/mL時(shí)有微量交叉反應(yīng)。
　　 4.抗體辣根過(guò)氧化物酶(peroxidase horseradish，HRP)標(biāo)記及其工作濃度的確定
　　 采用過(guò)改良過(guò)碘酸鈉法將抗體和HRP酶進(jìn)行偶聯(lián)，結(jié)果表明抗體與HRP成功偶聯(lián)，多抗-HRP工作濃度為1:200，單抗-HRP工作濃度

8、為1:320。
　　 5.ELISA檢測(cè)方法的對(duì)比試驗(yàn)
　　 建立了三種ELISA方法，分別為間接ELISA，單抗-抗原-酶標(biāo)多抗夾心ELISA和多抗-抗原-酶標(biāo)單抗夾心ELISA，分析對(duì)比三者的靈敏度、線性檢測(cè)范圍確定比較理想的ELISA。其中間接ELISA方法的最低檢測(cè)限為50ng/mL，其線性檢測(cè)范圍為100～400ng/mL；單抗-抗原-酶標(biāo)多抗夾心ELISA其最低檢測(cè)限為0.24ng/mL，其線性檢測(cè)范圍為0.

9、975～2.5ng/mL；多抗-抗原-酶標(biāo)單抗夾心ELISA其最低檢測(cè)限為1.95ng/mL，其線性檢測(cè)范圍為3.9～2.5ng/mL。單抗-抗原-酶標(biāo)多抗的檢測(cè)限濃度最低，線性檢測(cè)范圍最廣，因此單抗-抗原-酶標(biāo)多抗法是比較理想的一種ELISA方法。
　　 6.ELISA檢測(cè)方法的適用性
　　 從交叉反應(yīng)、回收率試驗(yàn)、實(shí)物樣品檢測(cè)等方面來(lái)對(duì)所獲得的ELISA方法的特異性、精確度和準(zhǔn)確性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：ELISA檢測(cè)

10、體系中所使用的兔抗體系與其他Bt蛋白(如Cry1Ab，Cry1c蛋白)無(wú)明顯交叉反應(yīng)。采用外標(biāo)法檢測(cè)水稻葉片，ELISA分析結(jié)果顯示其回收率可達(dá)89.2～121.92％，且其平均回收率可達(dá)103.35％。對(duì)轉(zhuǎn)基因樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陰性樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性，因此該ELISA方法能夠有效地識(shí)別轉(zhuǎn)基因樣品中的Cry1Ac蛋白。
　　 上述試驗(yàn)表明，研究所開(kāi)發(fā)的ELISA檢測(cè)體系能夠滿足對(duì)Cry1AC蛋白的檢測(cè)要