甜菜夜蛾和棉鈴蟲對(duì)Cry1Ca和Cry1Ac敏感性差異的機(jī)理研究.pdf

1、轉(zhuǎn)蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）晶體毒素(cry toxin)基因的棉花品種在我國(guó)已大面積種植多年。其應(yīng)用有效控制了靶標(biāo)害蟲——棉鈴蟲和棉紅鈴蟲的為害，提高了棉花的產(chǎn)量、質(zhì)量以及棉農(nóng)的收入，減輕了環(huán)境污染，防止了農(nóng)藥中毒。但是，隨著轉(zhuǎn)基因棉花的廣泛種植，棉田的次要害蟲如甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hubner)等上升為主要害蟲。原因之一是轉(zhuǎn)入棉花品種的Cry毒素基因大都由Cry1Ac基

2、因改造而來，其產(chǎn)物對(duì)甜菜夜蛾幼蟲毒力較差。國(guó)外的研究結(jié)果表明，Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca對(duì)甜菜夜蛾的毒力均顯著高于Cry1Ac，尤其Cry1Ca對(duì)甜菜夜蛾的毒力最強(qiáng)，是理想的替代毒素。
　　 昆蟲對(duì)Cry毒素的耐受性由多種原因決定。前毒素的溶解、酶解活化及失活、毒素穿過圍食膜與受體的結(jié)合、寡聚體形成及插入細(xì)胞膜、空洞的形成和腸道微生物的影響等過程都可能與耐受性相關(guān)。因此，我們比較研究了甜菜夜蛾和棉鈴蟲受體蛋白、中腸

3、蛋白酶及腸道微生物與Cry1Ac和Cry1Ca的互作，試圖揭示兩種害蟲對(duì)不同晶體蛋白敏感性差異的機(jī)制。
　　 1.甜菜夜蛾和棉鈴蟲鈣粘蛋白與Cry1Ca和Cry1Ac的互作
　　 克隆了甜菜夜蛾鈣粘蛋白基因全長(zhǎng)，命名為SeCad2，其氨基酸序列與棉鈴蟲的同源性高達(dá)59‰且存在三個(gè)與之相應(yīng)的保守的毒素結(jié)合位點(diǎn)。體外表達(dá)了甜菜夜蛾和棉鈴蟲包含三個(gè)毒素結(jié)合位點(diǎn)的鈣粘蛋白肽段，蛋白印跡、點(diǎn)雜交和增效實(shí)驗(yàn)都證明，鈣粘蛋白肽段與Cr

4、y1Ca和Cry1Ac的結(jié)合能力具有偏好性，且差異顯著。其中甜菜夜蛾的鈣粘蛋白肽段偏好與Cry1Ca結(jié)合，而棉鈴蟲鈣粘蛋白肽段偏好與Cry1Ac結(jié)合，與我們測(cè)定的兩種Bt對(duì)其敏感性差異是一致的。據(jù)此我們認(rèn)為，鈣粘蛋白與晶體毒素的互作與害蟲的敏感性差異相關(guān)。
　　 2.甜菜夜蛾堿性磷酸酶的分子克隆與特性分析
　　 克隆了甜菜夜蛾Bt次級(jí)受體堿性磷酸酶ALP1基因，發(fā)現(xiàn)ALP1在幼蟲中腸組織中表達(dá)量最高。比較了原核表達(dá)的Se

5、ALP1與Cry1Ca和Cry1Ac的結(jié)合能力差異，發(fā)現(xiàn)SeALP1偏好與Cry1 Ca結(jié)合。
　　 3.中腸蛋白酶對(duì)Cry毒素活性的影響
　　 通過甜菜夜蛾和棉鈴蟲中腸酶液對(duì)Cry1Ca和Cry1Ac的消化比較發(fā)現(xiàn)，兩種害蟲中腸酶液對(duì)其消化能力沒有明顯差異。但是昆蟲中腸液能對(duì)活化毒素過度消化，造成殘存完整的有活性的Bt減少，適量的蛋白酶抑制劑與活化毒素共同飼喂昆蟲可以抑制活化毒素的過度水解，對(duì)Bt活化毒素毒力有一定的增

6、效作用。
　　 4.青霉素影響甜菜夜蛾幼蟲耐受幾種蘇云金桿菌晶體蛋白的能力
　　 評(píng)估了Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca蛋白對(duì)甜菜夜蛾2齡幼蟲的毒力，LC50值分別為0.4425、0.6757和0.1502μg/cm2，Cry1Ba毒力最低，其次是Cry1Ab，而Cry1Ca毒力最高。青霉素影響幼蟲對(duì)晶體毒素的耐受能力。一次添加高劑量(500μg/cm2)青霉素于飼料中顯著提高幼蟲的耐受能力，以含低劑量(60μg