草甘磷抗性基因的重組表達及ELISA檢測方法初步建立.pdf

1、隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了一場新的革命，它使農(nóng)作物的品質(zhì)得以改良以及獲得高產(chǎn)增收，從而為減輕人口快速增長帶來的糧食危機做出了巨大貢獻。自從1995年轉(zhuǎn)基因生物大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)以來，轉(zhuǎn)基因作物在全球的種植面積逐年上升，到2008年種植面積已達1.25億公頃，其中抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的發(fā)展最為迅速，最具影響力。草甘膦是一種廣譜型滅生性除草劑。5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合成酶(5－enolpyruvyl sh

2、ikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)是植物和微生物中莽草酸途徑中的一個關(guān)鍵酶，是許多抗生素、除草劑作用的首選靶標(biāo)酶。草甘膦能與植物中的EPSPS結(jié)合導(dǎo)致植物死亡。從天然的農(nóng)桿菌菌系CP4中分離出的EPSPS酶有很好的抗草甘膦功能，這種酶稱為CP4－EPSPS。將細(xì)菌編碼CP4－EPSPS基因通過土壤農(nóng)癌桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，獲得了抗除草劑的轉(zhuǎn)基因大豆。但轉(zhuǎn)基因食品的安全性一直是人們所擔(dān)憂的問題，所以，建立

3、有效的轉(zhuǎn)基因檢測方法在當(dāng)今轉(zhuǎn)基因食品檢測中顯得尤為重要。
　　 本實驗旨在從轉(zhuǎn)基因大豆中克隆草甘膦抗性基因，并使其在大腸桿菌中大量表達。以此蛋白作為抗原，制備多克隆抗體，建立ELISA檢測方法，從而實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因大豆的監(jiān)控。
　　 采用CTAB方法從轉(zhuǎn)基因大豆中提取DNA，根據(jù)草甘膦抗性基因設(shè)計引物，利用PCR從大豆DNA中擴增出長度為1529 bp的草甘膦抗性基因片段，將該基因片段連接至表達載體pET-30a(+)中，并

4、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)進行誘導(dǎo)表達，獲得分子量為55 kD的重組蛋白。對誘導(dǎo)劑IPTG濃度和誘導(dǎo)時間進行優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)誘導(dǎo)條件：IPTG濃度為0.1 mmol/L，誘導(dǎo)時間為4 h。
　　 利用純化后的液體重組蛋白和SDS－PAGE切膠蛋白兩種形式抗原免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，并利用間接ELISA對抗體效價進行測定。兩種形式抗原獲得的多抗效價分別達到1:2700000和1:800000。通過Western b