H3N2亞型犬流感病毒江蘇分離株基因組特征與致病特性研究.pdf

1、犬流感是一種新發(fā)的，具有高度接觸傳播性的犬呼吸道傳染病，患犬主要表現(xiàn)為咳嗽、肺炎以及其他呼吸道癥狀。其病原犬流感病毒為A型流感病毒，基因組為分節(jié)段的單鏈負(fù)股RNA，這一特點(diǎn)使病毒易通過基因突變和基因重配不斷進(jìn)化。目前韓國和中國地區(qū)對(duì)犬群的流感抗體血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，H3N2犬流感病毒已在兩個(gè)國家的犬群中廣泛流行。犬作為一種伴侶動(dòng)物，與人的接觸十分密切，使人們擔(dān)心該病毒具有潛在的從犬傳播給人的可能性。因此，掌握犬流感病毒的進(jìn)化方向及其致病

2、生物學(xué)特性，有助于防控犬流感，特別是防止犬流感病毒傳播給人，降低對(duì)人的風(fēng)險(xiǎn)性具有重要意義。本研究對(duì)江蘇地區(qū)分離到的犬流感病毒進(jìn)行基因特性和致病生物學(xué)特性分析，并探討了其NA莖部?jī)蓚€(gè)氨基酸的插入對(duì)病毒復(fù)制的影響，為后續(xù)更深入地研究該病毒的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　1.江蘇地區(qū)H3N2亞型犬流感病毒的分離鑒定及其分子特性
　　2009-2010年，從江蘇地區(qū)分離到6株H3N2亞型犬流感病毒。病毒全基因組測(cè)序分析顯示，6株病毒之間同

3、源性99％以上，且均與韓國報(bào)道的從貓分離到的禽源犬流感病毒最相似。與同源性最高的禽流感病毒片段的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，6株病毒在血凝素1(HA1)片段上發(fā)生了許多重要的突變，如抗原位點(diǎn)區(qū)域:D81N，A160T和G209;受體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域:W222L;裂解位點(diǎn)區(qū)域:K326R;潛在糖基化位點(diǎn)區(qū)域:T10A和D81N;在神經(jīng)氨酸酶(NA)片段的抗原位點(diǎn)區(qū)域也發(fā)生了突變:S372L和R432G。值得一提的是，6株病毒在NA莖部的末端均出現(xiàn)

4、了2個(gè)氨基酸的插入，且該突變?cè)诖饲绊n國與廣東的犬流感病毒分離株中均未出現(xiàn)。系統(tǒng)發(fā)生樹分析顯示，6株病毒與此前韓國和中國地區(qū)分離到的H3N2亞型犬源及貓?jiān)戳鞲胁《揪谇萘鞲胁《咀V系內(nèi)，但與禽流感病毒不在一個(gè)分支，已形成獨(dú)立分支，同時(shí)6株病毒與韓國貓?jiān)慈鞲胁《居H緣關(guān)系最近。6株病毒中，06株較為特別:在M、NP和NA片段上，與其他5株病毒個(gè)別氨基酸不同;8個(gè)片段的系統(tǒng)發(fā)生樹上，06株毒均與其他5株毒關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn);06株毒的半數(shù)雞胚感染量(

5、EID50)最低。06株病毒的致病生物學(xué)特性值得進(jìn)一步研究。
　　2.H3N2亞型犬流感病毒江蘇分離株的致病生物學(xué)特性分析
　　選擇01株與06株病毒接種BALB/c小鼠，套式PCR檢測(cè)病毒臟器分布，發(fā)現(xiàn)兩組接毒小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、小腸以及糞中均能檢測(cè)到病毒RNA，且均在攻毒后第6天病毒臟器陽性比率最高。通過熒光定量比較兩組接毒小鼠在攻毒后第6天與第8天各臟器中的病毒RNA載量，顯示接種06株毒的小鼠各臟器中的平均

6、病毒載量較高。體重監(jiān)測(cè)結(jié)果也顯示接種06株病毒的小鼠體重下降更多。綜合EID50、病毒載量及體重下降結(jié)果，確定06株病毒有更強(qiáng)的毒力。進(jìn)一步免疫組織化學(xué)檢測(cè)和病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，接種06株毒的小鼠各臟器均能檢測(cè)到抗原，且各臟器出現(xiàn)了不同程度的病理損傷。體外感染試驗(yàn)表明，06株犬流感病毒可以感染多種細(xì)胞，包括3種傳代細(xì)胞系:犬腎細(xì)胞(MDCK)、人肺癌細(xì)胞(H292)、人肺腺癌細(xì)胞(A549)，3種原代細(xì)胞:犬細(xì)支氣管上皮細(xì)胞(CBE)、

7、犬細(xì)支氣管平滑肌細(xì)胞(BSM)、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，間接免疫熒光檢測(cè)進(jìn)一步說明受感染的細(xì)胞內(nèi)存在大量抗原。以上結(jié)果說明犬流感病毒對(duì)小鼠組織和體外培養(yǎng)細(xì)胞有廣泛的嗜性。
　　3.H3N2亞型犬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立及其NA突變株的構(gòu)建
　　為建立H3N2亞型犬流感病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，將犬流感病毒A/canine/Jiangsu/06/2010(H3N2)的8個(gè)基因片段與雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pB

8、D連接，構(gòu)建了犬流感病毒8個(gè)基因片段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)重組質(zhì)粒。利用8質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)，將重組的pBD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72h后細(xì)胞凍融液轉(zhuǎn)接MDCK細(xì)胞，并在MDCK細(xì)胞上傳3代后，成功拯救該病毒，命名為r-06。同樣的方法，以A/canine/Jiangsu/06/2010(H3N2)為框架，構(gòu)建了重組NA基因莖部缺失2個(gè)氨基酸的突變毒，命名為r-06/NA2。兩株拯救病毒的基因組經(jīng)測(cè)序均無突變。r-06/NA2病毒的成功構(gòu)建，為

9、研究NA莖部2個(gè)氨基酸插入對(duì)病毒復(fù)制和毒力的影響提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　4.H3N2亞型犬流感病毒NA莖部氨基酸插入對(duì)病毒林外復(fù)制的影響
　　為探討犬流感病毒江蘇分離株NA基因莖部2個(gè)氨基酸的插入對(duì)病毒體外復(fù)制的影響，比較了兩株拯救病毒r-06（長(zhǎng)莖病毒，NA莖部有2個(gè)氨基酸插入）與r-06/NA2（短莖病毒，NA莖部無氨基酸插入）在MDCK細(xì)胞、雞胚原代成纖維細(xì)胞和犬原代細(xì)支氣管平滑肌細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比r-06

10、/NA2病毒，r-06病毒在3株細(xì)胞上能達(dá)到更高的峰值滴度，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均產(chǎn)生更高的病毒滴度，而且在MDCK細(xì)胞上形成的空斑更大。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在MDCK與BSM細(xì)胞上，r-06病毒感染的細(xì)胞更多，但在CEF細(xì)胞上，兩株病毒感染的細(xì)胞數(shù)量一致。NS1蛋白表達(dá)量，在3株被感染的細(xì)胞內(nèi)，r-06病毒均顯著高于r-06/NA2病毒的表達(dá)量。紅細(xì)胞解凝試驗(yàn)結(jié)果顯示，2個(gè)氨基酸的插入有助于NA在犬紅細(xì)胞上釋放病毒粒子，而在雞紅細(xì)胞上則

11、沒有影響。以上結(jié)果表明，H3N2犬流感病毒NA莖部2個(gè)氨基酸的插入，增強(qiáng)了病毒的體外復(fù)制能力，推測(cè)該突變可能是病毒在犬體內(nèi)產(chǎn)生適應(yīng)性突變的結(jié)果。
　　5.H3N2亞型犬流感病毒NA莖部氨基酸插入對(duì)病毒體內(nèi)復(fù)制的影響
　　將r-06和r-06/NA2兩株病毒分別接種BALB/c小鼠，探討NA基因莖部2個(gè)氨基酸的插入對(duì)病毒體內(nèi)復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，兩組接毒小鼠體重均出現(xiàn)下降，但接種r-06病毒的小鼠體重下降更多。接種r-06病毒

12、的小鼠在攻毒后第6天與第8天病毒臟器分布最廣，且病毒臟器陽性比率均達(dá)到100％。接種r-06/NA2病毒的小鼠雖然也在攻毒后第6天與第8天病毒臟器分布最廣，但僅在第6天病毒臟器陽性比率達(dá)到100％。病理組織學(xué)觀察顯示，兩株病毒均能引起受感染小鼠肺部出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，但接種r-06病毒的小鼠肺部病變面積更大。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，攻毒后第6天，兩組小鼠腦中的病毒RNA載量差異顯著（P＜0.05）。同時(shí)，攻毒后第2天，接種r-06病毒的