TNF-α誘導B16細胞凋亡的核蛋白質組研究.pdf

1、細胞凋亡過程存在著一個復雜的調控網(wǎng)絡，許多蛋白質參與細胞凋亡的啟動和執(zhí)行過程。在細胞凋亡的過程中，許多蛋白質在不同的亞細胞器間存在轉位現(xiàn)象，包括質膜、內質網(wǎng)、線粒體和細胞核。其中細胞核是一個非常重要的細胞器，細胞凋亡的許多調控因子都是進入細胞核發(fā)揮作用的(如caspases、AIF和cytochromec等)。因此，分析細胞凋亡過程中核蛋白的動態(tài)變化，將有可能發(fā)現(xiàn)新的細胞凋亡相關蛋白。本課題的研究目的就是分析凋亡細胞和非凋亡細胞核蛋白的

2、變化，尋找新的凋亡相關蛋白，并分析其在細胞凋亡過程中可能的作用。 首先，用腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導小鼠黑色素瘤B16細胞凋亡，確定了細胞凋亡的合適的時相，采用細胞熒光染色、流式細胞術、Caspase-3活性測定等手段檢測TNF-α作用于B16細胞后不同時間點細胞的凋亡情況。結果表明，TNF-α能夠誘導B16細胞凋亡，并具有時效關系。通過流式細胞儀檢測TNF-α對細胞周期的影響，結果顯示，TNF-α作用于B16細胞后導致細

3、胞發(fā)生G1期阻滯。 為了尋找新的細胞凋亡相關蛋白，在TNF-α誘導小鼠黑色素瘤B16細胞凋亡36小時后收取細胞，分離了凋亡細胞，提取細胞核總蛋白質，進行二維電泳分離，通過計算機圖像分析，發(fā)現(xiàn)在凋亡細胞核中有11個蛋白發(fā)生了明顯的變化(蛋白濃度相差3倍以上)，其中6個蛋白下調，5個蛋白上調，對這11個差異蛋白質點分別進行質譜分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢，初步鑒定出這些差異蛋白。 其中4個含量增加的蛋白(HSP84，calreticu

4、lin，vimentin，GAPDH)均直接或間接地參與細胞凋亡有關，另外一個含量增加的蛋白(plasminogen)尚未見其與細胞凋亡有關的報道。而6個含量降低的蛋白分別屬于信號轉導相關蛋白(guaninenucleotidebindingprotein，lamininreceptor1)、轉錄調控蛋白(heterochromatinprotein1alpha，heterogeneousnuclearribonucleoprotein

5、A3，heterogeneousnuclearribonucleoproteinA2/B1)和未知功能蛋白(nucleolarproteinNO38)。細胞凋亡過程中這些變化的核蛋白的發(fā)現(xiàn)將有助于深入認識細胞凋亡的分子機制。 三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)是糖酵解過程中的一個關鍵酶，與ATP的合成密切相關。近年來越來越多的研究表明，GAPDH存在許多異構體，其功能也不僅僅是參與能量代謝，還參與tRNA的轉運、DNA的復制和修復

6、，以及細胞內吞等生命活動過程。另外，GAPDH還與多種因素介導的神經(jīng)元凋亡有關。 我們在研究TNF-α誘導的B16細胞凋亡時發(fā)現(xiàn)，凋亡組細胞核中GAPDH蛋白濃度較對照組明顯上調。那么GAPDH是否參與了神經(jīng)元以外其它細胞尤其是腫瘤細胞的凋亡過程?為此，我們分析、觀察了TNF-α誘導細胞凋亡過程GAPDH的動態(tài)變化以及這些變化對凋亡的影響。通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，GAPDH誘導細胞凋亡過程中，細胞質中的GAPDH的量

7、略有下降，而細胞核中GAPDH的量則明顯上升，說明在細胞凋亡的過程中，GAPDH發(fā)生了核轉位。在此基礎上，構建了帶有綠色熒光蛋白標簽的GAPDH表達載體pEGFP-GAPDH，用此載體轉染B16細胞，通過熒光顯微鏡觀察細胞凋亡過程中GAPDH的動態(tài)變化，結果并未發(fā)現(xiàn)GAPDH在TNF-α誘導的細胞凋亡過程中有明顯的核轉位現(xiàn)象，這可能是由于在細胞凋亡的過程中，只有少量的GAPDH參與核轉位，而通過普通熒光顯微鏡觀察很難分辨出來。

8、為了分析GAPDH核轉位對細胞凋亡的影響，又構建了帶有核定位信號的GAPDH表達載體pEGFP-GAPDH-NLS。用pEGFP-GAPDH-NLS轉染B16細胞，在陽性的轉染細胞中，帶有EGFP的GAPDH定位于細胞核中，但并未發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征。這說明在細胞凋亡過程中，GAPDH存在核轉位現(xiàn)象，但這種現(xiàn)象也許只是細胞凋亡過程的伴隨現(xiàn)象。 另外，用pEGFP-GAPDH和pEGFP-GAPDH-NLS載體分別轉染B16

9、細胞后，通過FACS分析了轉染細胞的細胞周時相，結果發(fā)現(xiàn)，與只轉染pEGFP空載體的細胞相比，轉染GAPDH的細胞在60h時出現(xiàn)明顯的G1期阻滯現(xiàn)象。但尚不清楚GAPDH的高表達導致細胞發(fā)生G1期阻滯是否與細胞凋亡進程有關。 總之，通過本研究發(fā)現(xiàn)了TNF-α誘導小鼠黑色素瘤B16細胞凋亡過程中出現(xiàn)G1期阻滯現(xiàn)象；通過雙向電泳和質譜鑒定發(fā)現(xiàn)了11種核蛋白，它們可能參與細胞凋亡進程。另外，通過westernblot證明，TNF-α誘