擬南芥兩個在花中特異表達的Sec14-like磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白的分子生物學研究.pdf

1、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白(PITP)普遍存在于多細胞動物、真菌及高等植物中。PITP能結(jié)合及交換一分子的磷脂酰肌醇或磷脂酰膽堿并能促進這兩類脂分子在細胞內(nèi)膜組分間轉(zhuǎn)移。磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白在哺乳動物細胞分泌囊泡的形成、運輸、PLC(磷脂酶C)調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導以及神經(jīng)退化中具有重要的作用；PITP調(diào)節(jié)酵母胞質(zhì)內(nèi)膜組分運輸和脂類的代謝；在高等植物的發(fā)育過程中參與了信號的轉(zhuǎn)導。根據(jù)氨基酸序列的保守性，PITP可以分成兩大類：一類是以哺乳動物、兩棲動物和

2、昆蟲為代表的多細胞動物PITP；另一類是以真菌和高等植物為主的PITP。Sec14p是酵母中主要的PITP，對于酵母的存活和高爾基蛋白質(zhì)的分泌都具有重要的作用。目前研究較多的是哺乳動物和酵母的PITP，而植物PITP的生理生化功能研究較少，特別是在有性生殖中的生物學功能尚未見報道。 根據(jù)擬南芥中的全基因組信息，通過生物信息學分析表明擬南芥可能存在著31個編碼Sec14p結(jié)構(gòu)域的植物PITP。利用公共數(shù)據(jù)庫中全的長cDNA的信息

3、，我們分離并鑒定了擬南芥中的兩個主要在花器官中表達的Sec14-like的PITP基因，分別命名為AtSFH3和AtSFH12。它們分別編碼548和543個氨基酸的蛋白。在其C末端連接著Sec14p-like的脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)，在N末端是一個Nlj16-like結(jié)構(gòu)域。通過氨基酸序列比對分析表明，它們的脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Sec14p具有40％以上的相似性。 在酵母的功能互補試驗中，我們將AtSFH3和AtSFH12的全長cD

4、NA導入了兩個酵母Sec14ts單缺失突變體NY430和PGY84中。試驗結(jié)果表明，在限制性溫度37℃下，兩個基因的全長cDNA都能較好的互補Sec14p缺失引起的生長缺陷。 利用半定量RT-PCR檢測AtSFH3和AtSFH12在組織器官特異性表達的結(jié)果表明，AtSFH3和AtSFH12主要在花器官中表達。其中，AtSFH3在擬南芥的花、莖和莢果中表達，且表達量依次降低，而在根和葉沒檢測到其轉(zhuǎn)錄活性；AtSFH12在花中的轉(zhuǎn)

5、錄活性最高，在其他器官的轉(zhuǎn)錄活性極低或者是不表達。這些研究結(jié)果和公共數(shù)據(jù)庫中的基因芯片結(jié)果是一致的。 為了進一步比較AtSFH3和AtSFH12在花器官的定位，我們構(gòu)建了Promoter-GUS轉(zhuǎn)基因株系研究AtSFH3和AtSFH12在花器官的精確定位，結(jié)果表明:AtSFH3和AtSFH12在花發(fā)育的不同時期及花的亞器官的分布具有較大的區(qū)別?；òl(fā)育的第11期，在花柱的表皮細胞表達能觀察到AtSFH3的表達，到了第12期AtS

6、FH3在成熟的孢粉囊中也有表達，在花發(fā)育的第13時期，花柱的表皮細胞，花柱中都能檢測到AtSFH3的表達，在成熟的花粉粒和落在柱頭上萌發(fā)的花粉也能觀察到AtSFH3的表達，表明AtSFH3在雌蕊和雄蕊都有表達。而AtSFH12只在花發(fā)育的第12時期的成熟花粉囊中開始表達，到了第13期，花粉粒在柱頭上萌發(fā)時，萌發(fā)的花粉管中也能檢測到GUS活性，說明在花的整個發(fā)育過程中，AtSFH12僅在成熟及萌發(fā)的花粉粒中有表達，在花器官的其他組織如雌蕊