白介素-10對人CD14+成熟樹突狀細胞的細胞骨架的影響及潛在分子機制的研究.pdf

1、目的：本課題主要研究白介素10（interleukin-10,IL-10）對人成熟樹突狀細胞（mature dendritic cells,mDCs）骨架蛋白的影響及分子機制，為提高DCs的抗腫瘤疫苗的療效提供理論依據(jù)。
　　方法：首先利用NCBI中的基因表達綜合庫（GEO）基因芯片GSE45466，使用R語言軟件（RGui3.2.3）解析原始數(shù)據(jù)（.IDAT）并進行歸一化數(shù)據(jù)處理，篩選差異基因（log|FC|≥2,P-value

2、<0.05）進行京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and geno mes,KEGG）分析以及基因本體論（gene ontology,GO）分析，利用STRIN G online工具進一步篩選可信差異基因（可信度≥1），Cytoscape軟件構(gòu)造蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖并篩選核心基因。完成生物信息學分析后進行試驗驗證，利用免疫磁珠篩選新鮮人外周血中的CD14+單核細胞，利用人重組粒細胞巨噬細胞

3、刺激因子（hu-man recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating facto r,hrGM-CSF）、人重組白細胞介素4（hu-man recombinant interleukin-4,hrIL-4）、人重組腫瘤壞死因子α(hu-man recombinant tumor necrosis factorα,hrTN F-α)體外誘導(dǎo)為mDCs，用10ng/ml IL-1

4、0分別處理mDCs45min、2h、4h、8h、12h、24h；觀察mDCs跨內(nèi)皮遷移能的變化，并觀察聯(lián)合使用STAT3磷酸化抑制劑Stattic后，IL-10對mDCs跨內(nèi)皮遷移能的影響。利用Western Blot驗證IL-10下游信號通路，利用試劑盒檢驗RhoA/Rac1/Cdc42激活改變，激光共聚焦顯微鏡檢測mDCs在IL-10處理4h后，細胞骨架F-actin、STAT3及pS TAT3的結(jié)構(gòu)與分布情況。
　　結(jié)果：基

5、因芯片結(jié)果顯示IL-10處理mDCs45min差異基因8個，2h差異基因18個,處理4h差異基因26個，8h差異基因30個，12h差異基因19個（變化倍數(shù)≥2）。這些基因主要涉及細胞內(nèi)細胞粘附、信號傳遞、免疫應(yīng)答等。Transwell結(jié)果示10ng/ml IL-10共培養(yǎng)4h后，mDCs跨內(nèi)皮遷移能力顯著下降，Western blot結(jié)果示10ng/ml IL-10處理2h后，mDCs中pSTAT3明顯上調(diào)，pSTAT1，pSTAT5沒

6、有明顯改變；經(jīng)由STAT3磷酸化抑制劑Stattic阻斷后，mDCs的跨內(nèi)皮遷移能力較未抑制組有明顯改善，激光共聚焦顯微鏡下，10ng/ml IL-10處理后mDCs中的F-actin含量以有明顯上升，這一現(xiàn)象在經(jīng)Stattic阻斷IL-10/STAT3通路后恢復(fù)，同時STAT3與pSTAT3的表達量改變與Western blot結(jié)果相一致，利用小r蛋白家族pull-down實驗試劑盒檢驗Rho A，CDC42，Rac1的磷酸化水平。<