煙酸受體GPR109a信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 1．構(gòu)建野生型煙酸受體GPR109a、C末端4個(gè)缺失體和C末端的點(diǎn)突變體。
　　 2．尋找對(duì)GPR109a受體內(nèi)吞起關(guān)鍵作用的磷酸化位點(diǎn)。
　　 3．分析突變體對(duì)受體胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的影響。
　　 方法：
　　 1．提取人基因組并PCR擴(kuò)增煙酸受體GPR109a基因，構(gòu)建到載體pEGFP-N1。
　　 2．分別構(gòu)建煙酸受體GPR109a的C末端Δ295-314，Δ315-326，

2、Δ327-343，△344-363四個(gè)缺失體，并檢測(cè)各缺失體的膜定位和內(nèi)吞情況。
　　 3．利用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建煙酸受體GPR109a C末端點(diǎn)突變體GPR109a(T318A)、GPR109a(S326A)、GPR109a(T327A)、GPR109a(T332A)和GPR109a(T338A)。
　　 4．利用檢測(cè)胞內(nèi)第二信使cAMP變化和蛋白免疫印跡(Western Blotting)的方法觀察各突變體下游信號(hào)轉(zhuǎn)

3、導(dǎo)的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1．缺失體Δ295-314主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，不能定位到細(xì)胞膜上，主要是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
　　 2．缺失體Δ315-326和△327-343在配體刺激后不能夠發(fā)生內(nèi)吞。
　　 3．點(diǎn)突變體GPR109a(S326A)、GPR109a(T327A)在配體刺激后不能夠發(fā)生內(nèi)吞。
　　 4．點(diǎn)突變體GPR109a(S326A)、GPR109a(S327A)不影響胞內(nèi)第二

4、信使cAMP信號(hào)的改變。
　　 5．缺失體Δ315-326和點(diǎn)突變體GPR109a(S326A)、GPR109a(S327A)不影響胞內(nèi)下游ERK1/2磷酸化的水平。
　　 結(jié)論：
　　 1．煙酸受體GPR109a第295-314位的氨基酸序列YFSSPSFPNF影響了受體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)裝運(yùn)至細(xì)胞膜的過程
　　 2．煙酸受體GPR109a C末端第326位絲氨酸和第327位蘇氨酸是GRK2磷酸化受體的關(guān)鍵位點(diǎn)。