脂肪源性干細(xì)胞在乳腺整形中的基礎(chǔ)研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著干細(xì)胞研究的深入，成體干細(xì)胞逐漸顯示出越來(lái)越多的優(yōu)勢(shì)，它具有來(lái)源豐富，可塑性強(qiáng)，離成熟細(xì)胞較近，具有多向分化潛能等特點(diǎn)。最大特色是可以實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，無(wú)免疫排斥問(wèn)題，因而將優(yōu)先進(jìn)入臨床使用。它可以從接受治療者體內(nèi)直接分離，進(jìn)行體外大量增殖，并誘導(dǎo)分化為所需要的細(xì)胞種類(lèi)，然后再將它們移植回接受治療者體內(nèi)，這樣就不會(huì)因發(fā)生免疫排斥反應(yīng)而失敗，同時(shí)還可以避免因使用胚胎干細(xì)胞所帶來(lái)的倫理上的爭(zhēng)端和成瘤性的危險(xiǎn)。 脂肪源性干

2、細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞。經(jīng)研究證實(shí)它具有易于分離，易于培養(yǎng)，傳代多次而沒(méi)有明顯衰減的生物學(xué)特性，并有多向分化潛能，能在體外培養(yǎng)情況下，經(jīng)添加特異性誘導(dǎo)培養(yǎng)基定向分化培養(yǎng)成為成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，心肌細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，并能跨胚層分化為上皮細(xì)胞，肝樣細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞，從而顯示了它作為一種細(xì)胞治療的良好載體和組織工程中種子細(xì)胞的廣闊的臨床應(yīng)用價(jià)值。 目前所進(jìn)行的有關(guān)脂肪源性干細(xì)胞的研究主要集中在它具有的一些生物學(xué)特性上，主要

3、是一些細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)，沒(méi)有細(xì)胞在活體動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)觀察。本研究為了能進(jìn)一步開(kāi)發(fā)它在組織工程中的應(yīng)用價(jià)值，特別是乳腺整形中的作用，希望它作為脂肪組織工程的種子細(xì)胞能盡早進(jìn)入臨床應(yīng)用，做了脂肪源性干細(xì)胞的脂肪定向誘導(dǎo)分化及動(dòng)物體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榕R床脂肪顆粒注射治療存在高吸收率問(wèn)題，而且一次獲得的細(xì)胞數(shù)量有限，需要多次注射，故本研究也模擬臨床情況進(jìn)行細(xì)胞多次注入。 研究目的： 從脂肪組織中分離，培養(yǎng)，鑒定脂肪源性干細(xì)胞并誘

4、導(dǎo)成為為脂肪細(xì)胞，將經(jīng)過(guò)BrdU標(biāo)記并誘導(dǎo)后的細(xì)胞多次注入NOD-SCID小鼠體內(nèi)，觀察細(xì)胞在活體動(dòng)物體內(nèi)的生長(zhǎng)情況和對(duì)動(dòng)物的影響。 研究方法： 1．無(wú)菌技術(shù)取SD大鼠雙側(cè)腹股溝脂肪墊，用I型膠原酶消化，獲取脂肪源性干細(xì)胞，接種于含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，觀測(cè)其生長(zhǎng)情況，繪制生長(zhǎng)曲線，鑒定其表面分子標(biāo)志CD29,CD44,CD45。 2．添加脂肪定向誘導(dǎo)劑，將脂肪源性干細(xì)胞誘導(dǎo)成為脂肪細(xì)胞，并

5、用油紅O染色鑒定。 3．將經(jīng)過(guò)BrdU標(biāo)記并誘導(dǎo)后的脂肪細(xì)胞連續(xù)三次，每次間隔十天，接種于NOD-SCID小鼠一側(cè)皮下，對(duì)側(cè)空白對(duì)照，觀察小鼠生長(zhǎng)情況并在注射細(xì)胞結(jié)束后一個(gè)月和兩個(gè)月取材，觀察組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并用油紅O染色鑒定，BrdU免疫組化鑒定。 研究結(jié)果： 1．脂肪源性干細(xì)胞易于分離，培養(yǎng)，具有穩(wěn)定的擴(kuò)增能力，可傳代十次，不易衰減。細(xì)胞表面分子標(biāo)志鑒定結(jié)果：CD29,CD44分別為95％，98％，C

6、D45為6％。 2．通過(guò)添加脂肪定向分化誘導(dǎo)劑，于培養(yǎng)第四天前后細(xì)胞出現(xiàn)脂滴，十天后脂肪細(xì)胞生成率60％以上，細(xì)胞形態(tài)學(xué)和油紅O染色證實(shí)為脂肪細(xì)胞定向分化。繼續(xù)培養(yǎng)可見(jiàn)細(xì)胞變圓從培養(yǎng)瓶底壁游離。 3．將BrdU標(biāo)記過(guò)并誘導(dǎo)而生成的成熟脂肪細(xì)胞接種入NOD-SCID小鼠一側(cè)背部皮下，對(duì)側(cè)空白對(duì)照。觀察到小鼠生長(zhǎng)良好，注射細(xì)胞側(cè)可見(jiàn)局部隆起，隆起直徑約1cm，厚約2mm。對(duì)側(cè)陰性。經(jīng)組織切片發(fā)現(xiàn)存活于小鼠體內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)正

7、常，沒(méi)有異型性，經(jīng)油紅O染色證實(shí)為成熟脂肪組織。本實(shí)驗(yàn)分別觀察了細(xì)胞注入NOD-SCID小鼠皮下一個(gè)月和兩個(gè)月后的情況，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)月小鼠的移植脂肪細(xì)胞較一個(gè)月小鼠的移植脂肪細(xì)胞直徑增大，表明經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有良好的生長(zhǎng)能力，能適應(yīng)從體外到體內(nèi)的生存環(huán)境，并隨著環(huán)境的變化而變化，這一點(diǎn)體現(xiàn)在它能隨著小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育而積聚脂肪，成為成熟脂肪組織。而且因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中細(xì)胞為多次注入，也為臨床中分離培養(yǎng)細(xì)胞后多次治療提供了一定的參考價(jià)值，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)成活

8、的脂肪組織中并沒(méi)有明顯的血管的生成，這說(shuō)明成活的細(xì)胞可能主要是靠局部滲出的組織間液存活，同時(shí)因?yàn)榫植恐镜暮穸葍H為2mm左右，這也間接說(shuō)明血管化的障礙可能也是影響細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素。 結(jié)論： 1．脂肪源性干細(xì)胞易于提取，易于培養(yǎng)，不需額外添加很多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就可生長(zhǎng)良好。 2．脂肪源性干細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖旺盛，經(jīng)十次傳代無(wú)明顯衰減。 3．脂肪源性干細(xì)胞經(jīng)CD29,CD44單克隆抗體表面標(biāo)記陽(yáng)性率高。CD