脂肪源性干細胞對大鼠陰道粘膜下脫細胞心包膜移植物的影響.pdf

1、【研究背景】
　　女性盆底功能障礙性疾?。≒elvic floor dysfunctional diseases，PFD）的發(fā)病率逐年升高，是中老年婦女的常見疾病，經產婦有將近50％會發(fā)生盆腔臟器脫垂（Pelvic organ prolapse，POP）。隨著世界各國特別是發(fā)達國家人口老齡化日趨嚴重，盆底功能障礙性疾病越來越引起人們的重視。女性POP患者中11%需要手術治療，并且30%需要再次手術。為降低POP術后復發(fā)率，運用合成

2、補片及生物補片對盆底進行修復逐漸增加。
　　聚丙烯網片是合成補片的代表，采用聚丙烯網片的全盆底重建手術術后治愈率明顯高于傳統(tǒng)手術，但由于人工合成網片的盆底重建手術存在術后陰道壁柔軟性差、網片的侵蝕率高(2%-29%)，以及性交痛等相關并發(fā)癥。而采用生物補片的全盆底重建手術具有較好的生物相容性，術后陰道壁柔軟性較好、補片侵蝕率低、并發(fā)癥少等，且植入人體后的降解周期與誘導周圍組織再生能力的矛盾影響其遠期治療效果。因此，應用組織工程學方

3、法構建組織工程補片，利用干細胞在體內的增殖、分化潛能，使盆底組織再生，有望提高生物補片的遠期療效。種子細胞的選擇是組織工程學的關鍵。脂肪源性干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）來源于脂肪組織，具有多項分化潛能、促進組織生長、旁分泌及免疫調節(jié)等功能。區(qū)別于胚胎干細胞與骨髓源性干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs），ADSCs具有如下優(yōu)點：

4、　　1）取材方便，來源豐富；
　　2）無倫理問題；
　　3）體外培養(yǎng)擴增容易；
　　4）分化能力與年齡無關。
　　ADSCs作為種子細胞，是構建組織工程補片的最佳選擇。
　　本課題利用大鼠ADSCs載入生物補片，構建大鼠ADSCs-生物補片復合物，體外實驗檢測其生物相容性，并將復合物植入大鼠陰道粘膜下組織中，觀察大鼠ADSCs對不同的生物材料在局部組織中的炎性反應、血管生成、膠原合成的影響，為盆腔器官脫垂手

5、術新型的生物組織工程學材料的研發(fā)提供實驗數據。
　　【研究目的】
　　1.大鼠ADSCs載入脫細胞豬心包膜（acellular porcine pericardium，APP）和脫細胞牛心包膜（acellular bovine pericardium，ABP）形成新型的組織工程補片，觀察APP和ABP與大鼠ADSCs在體外的生物相容性。
　　2.構建大鼠陰道粘膜下植入ECM模型，橫向比較APP和ABP在體內的生物相容性

6、，觀察ADSCs對APP和ABP植入局部組織的炎性反應、血管生成及膠原合成的影響，探討新型的干細胞-生物補片復合材料用于盆腔器官脫垂手術的可行性。
　　【研究方法】
　　1.取雌性大鼠（180±20g）腹股溝脂肪墊，經過酶消化分離獲取ADSCs。第3代ADSCs懸液，滴注在APP和ABP的漿膜層和纖維層，培養(yǎng)7天后，掃描電鏡觀察ADSCs的生長狀況。
　　2.構建雌性去勢大鼠（200±20g）陰道粘膜下補片植入模型。將

7、脫細胞豬和牛心包膜、復合ADSCs的脫細胞豬和牛心包膜植入大鼠陰道粘膜下，在SPF級條件下飼養(yǎng)30天。大鼠處死后取材，進行HE染色、Masson三色染色及CD34免疫組織染色，分析炎癥反應、膠原含量及新生血管數量的變化。
　　【結果】
　　1.脫細胞豬和牛心包膜的微觀結構：掃描電鏡顯示，APP纖維層纖維絲細微，呈小股結合，散開分布，表面參差不平，高低落差明顯。ABP纖維層纖維絲結股，并行排列，結構致密，表面較平整。APP漿膜

8、層纖維絲結成致密的網狀結構，網孔細小，表面平滑。ABP的堅韌與微觀結構所見一致。ABP漿膜層與APP類似。
　　2. ADSCs在兩種AP上的形態(tài)及分布特征：ADSCs載入APP和ABP體外培養(yǎng)1天后，掃描電鏡下見APP和ABP表面均有大量ADSCs粘附和增殖，ADSCs形態(tài)大部分呈紡錘體樣，少量呈成纖維細胞樣，部分融合生長；ADSCs載入APP和ABP體外培養(yǎng)7天后，ADSCs形態(tài)大部分已呈成纖維細胞樣，細胞膜突觸豐富，伸出偽足

9、爬行于材料表面，大部分ADSCs融合生長。APP與ABP的漿膜層表面平滑，而ABP的纖維層較平整，ADSCs呈水平分布。APP的纖維層，ADSCs細胞隨纖維絨毛散在、落差分布。
　　3.成功構建雌性去勢大鼠陰道粘膜下生物補片植入模型。該模型構建方法簡易，成模率高，達100%，未見感染、血腫、排斥等并發(fā)癥。
　　4.建模后飼養(yǎng)30天后，大體標本觀察：補片無侵蝕及攣縮，透過陰道粘膜仍可見植入的AP形態(tài)完整，觸摸補片植入局部組織柔

10、軟度APP比ABP更佳，而ABP材料堅韌，異物感明顯。兩種AP材料周圍均可見結締組織包被。
　　5.建模后飼養(yǎng)30天后，標本組織學分析：
　　5.1、HE染色：除對照組外，各組材料周圍可見纖維結締組織包被，均可見炎癥細胞浸入，且炎癥細胞以淋巴細胞為主，少量成纖維細胞，偶可見中性粒細胞。
　　5.2、各組間巨噬細胞及異物巨細胞計數的比較：APP組、ABP組、APP+ADSCs組與ABP+ADSCs組巨噬細胞及異物巨細胞計

11、數分別為：13.85±6.04/5HPFs、5.84±3.27/5HPFs、4.08±3.05/5HPFs、1.15±0.64/5HPFs。APP組與ABP組、APP組與APP+ADSCs組、ABP組與ABP+ADSCs組比較，局部炎癥細胞浸潤明顯增加，巨噬細胞及異物巨細胞計數明顯增加，材料降解明顯（P<0.05）。APP組與ABP組比較，APP組炎癥細胞浸潤明顯高于ABP組，巨噬細胞及異物巨細胞計數明顯增加，APP較ABP降解更明顯（

12、P<0.05）。
　　5.3、各組間血管密度的比較：APP組、ABP組、APP+ADSCs組與ABP+ADSCs組CD34免疫組化染色血管密度分別為：6.15±1.48/5HPFs、8.0±2.755/HPFs、6.2±1.585/HPFs、6.4±1.40/5HPFs。各組間血管密度無顯著差異（P>0.05）。
　　5.4、各組間膠原含量的比較：Masson三色染色APP組可見圖片中大量紅色，綠色膠原含量明顯減少，APP組

13、、ABP組、APP+ADSCs組與ABP+ADSCs組膠原含量分別為：0.127±0.014mm2、0.169±0.012mm2、0.151±0.003mm2、0.161±0.017mm2。APP組與ABP組及APP+ADSCs組比較，均有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。ABP組與ABP+ADSCs比較，無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　【結論】
　　1.大鼠陰道粘膜下植入ECM模型，操作簡易，成模率高，是研究盆底重建手術輔助