移植脂肪源干細(xì)胞對(duì)D-半乳糖衰老大鼠的影響.pdf

1、背景:
　　 衰老是整個(gè)機(jī)體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能的全面衰退,是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、復(fù)雜的過程。當(dāng)前預(yù)防和延緩衰老已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。原林教授提出的“筋膜學(xué)假說”認(rèn)為人體是由尚未分化的非特異性結(jié)締組織(筋膜)支架所構(gòu)成的支持與儲(chǔ)備系統(tǒng)和以已分化功能細(xì)胞為基礎(chǔ)的功能系統(tǒng)所共同構(gòu)成。功能系統(tǒng)在支持與儲(chǔ)備系統(tǒng)支持下維持結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定,支持與儲(chǔ)備系統(tǒng)不斷的為功能系統(tǒng)的細(xì)胞更新和功能活動(dòng)提供源源不斷的細(xì)胞源泉和細(xì)胞活動(dòng)所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。功能系

2、統(tǒng)是建立在功能細(xì)胞的專能特化基礎(chǔ)上的,而支持與儲(chǔ)備系統(tǒng)的筋膜支架是以干細(xì)胞為核心,通過分化出各種定向干細(xì)胞,為功能系統(tǒng)的更新提供源源不斷的細(xì)胞補(bǔ)充,并為功能系統(tǒng)的各種細(xì)胞的更新、代謝提供一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境。衰老是筋膜中干細(xì)胞儲(chǔ)備逐漸耗竭的過程,而如何保持筋膜的正常狀態(tài),為功能系統(tǒng)提供穩(wěn)定的細(xì)胞來源并維持其向功能細(xì)胞的正常分化,是延長生命周期的關(guān)鍵。如果衰老時(shí)減少的干細(xì)胞能得到及時(shí)的補(bǔ)充,為機(jī)體提供新的細(xì)胞儲(chǔ)備,可修復(fù)機(jī)體損傷,延緩衰老、

3、延長生命周期。
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(menchymal stem cells)具有自我更新、多向分化的能力。最初是由Friendenstein等發(fā)現(xiàn),且證明其在體外可以分化成為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞,而后其它的研究小組發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSCs不僅可以分化為中胚層來源的組織,而且可以分化為內(nèi)胚層和外胚層來源的組織。間充質(zhì)干細(xì)胞的多組織來源與筋膜結(jié)締組織支架的全身分布是一致的,其縱向、橫向分化的生物學(xué)特性與筋膜學(xué)提出的筋膜結(jié)締組織對(duì)機(jī)體的

4、支持儲(chǔ)備作用也是一致的。ADSCs是筋膜中未分化干細(xì)胞的一種儲(chǔ)備形式。ADSCs具有多分化潛能,能夠跨胚層分化。ADSCs具有低免疫原性,免疫調(diào)節(jié)功能和分泌細(xì)胞因子等能力為異體移植提供了有利條件,使ADSCs成為生物治療的亮點(diǎn)之一；ADSCs分泌細(xì)胞因子抗老化的作用,已經(jīng)被臨床廣泛應(yīng)用。ADSCs不僅可以用來進(jìn)行各種退行性和衰竭疑難病的替代治療,而且可用來進(jìn)行輔助的免疫治療。ADSCs可能通過以下機(jī)制修復(fù)或者重建組織:首先,ADSCs被

5、植入一個(gè)受損的或是壞死的組織,它們能以副分泌的方式分泌出細(xì)胞活素和生長因子以刺激修復(fù)。ADSCs可以提供抗氧化劑、自由基清除劑、熱休克蛋白等給待修復(fù)組織,從而清除局部環(huán)境中所釋放的有毒物質(zhì),促進(jìn)仍存活的細(xì)胞的修復(fù)。另外,ADSCs可以通過刺激內(nèi)生性干細(xì)胞補(bǔ)充到待修復(fù)的臟器或自身直接遷移補(bǔ)充到待修復(fù)區(qū)域,以調(diào)節(jié)干細(xì)胞的微環(huán)境,并且促進(jìn)它們沿著需要的方式分化為功能細(xì)胞,從而更新機(jī)體衰老的功能細(xì)胞,維持機(jī)體平衡。
　　 D-gal所致

6、亞急性衰老模型是國內(nèi)外比較公認(rèn)的衰老模型。在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)給動(dòng)物注射D-半乳糖使機(jī)體細(xì)胞糖代謝及脂代謝紊亂,不僅破壞并消耗機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)使自由基積聚,同時(shí)還使機(jī)體細(xì)胞膜脂質(zhì)受損,過氧化脂質(zhì)、脂褐素增高,出現(xiàn)衰老。D-半乳糖模型因全面影響細(xì)胞的代謝功能和一些重要的酶的功能,所導(dǎo)致的老化較全面。其老化與機(jī)能減退具體機(jī)制可能與代謝障礙、免疫損傷、自由基損傷及線粒體損傷等相關(guān)。
　　 為探討外源性脂肪源干細(xì)胞移植是否具有延緩衰老的作

7、用,本實(shí)驗(yàn)觀察移植ADSCs對(duì)D-半乳糖(D-gal)衰老大鼠自由基及免疫等方面及衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶及性能力等方面的影響,探索一種新的抗衰老機(jī)制,為臨床延緩衰老的治療提供新的思路和方法。
　　 目的
　　 研究移植脂肪源干細(xì)胞對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠相關(guān)衰老指標(biāo),學(xué)習(xí)記憶能力及交配能力的影響,進(jìn)一步為筋膜結(jié)締組織為于細(xì)胞的儲(chǔ)備源泉提供證據(jù)支持,為筋膜學(xué)提供理論支撐,并探討臨床替代療法的治療機(jī)理。
　　 1、判斷非特異

8、性筋膜結(jié)締組織中是否存在脂肪源干細(xì)胞；
　　 2、觀察移植脂肪源干細(xì)胞能否對(duì)D-半乳糖衰老大鼠自由基及免疫功能產(chǎn)生影響,闡述移植脂肪源干細(xì)胞對(duì)抗D-半乳糖衰老的血清學(xué)意義；
　　 3、通過Morris迷宮,研究移植筋膜結(jié)締組織中的脂肪源干細(xì)胞能否對(duì)D-半乳糖衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生影響；通過免疫組織化學(xué)染色,觀察海馬錐體細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,及其凋亡狀況。
　　 4、通過交配實(shí)驗(yàn),研究移植筋膜結(jié)締組織中的脂肪源干細(xì)胞能

9、否提高D-半乳糖衰老大鼠的性能力；通過免疫組織化學(xué)染色,觀察移植標(biāo)記的脂肪源干細(xì)胞在睪丸組織中的定位和移位情況,及睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌3β-HSD情況。通過血清學(xué)檢測(cè),觀察睪酮分泌狀況。為“筋膜學(xué)”抗衰老相關(guān)理論提供進(jìn)一步佐證。
　　 方法
　　 1、取成年大鼠腹股溝脂肪摯,酶消化法分離、培養(yǎng)筋膜結(jié)締組織脂肪源干細(xì)胞。通過形態(tài)學(xué)、功能學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)鑒定非特異性筋膜結(jié)締組織源細(xì)胞是否符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性,以判斷非特異性筋膜結(jié)

10、締組織中是否含有間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2、90只SD大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組(A組)、模型組(B組)和治療組(C組)。B、C組頸背部皮下注射15％D-半乳糖1000mg/(kg·d),連續(xù)8周復(fù)制亞急性衰老模型,空白對(duì)照組大鼠每天給予生理鹽水1.6ml頸背部皮下注射。
　　 3、造衰老模型成功后,細(xì)胞治療組大鼠行脂肪源干細(xì)胞靜脈移植。用于移植的第4代ADSCs在進(jìn)行傳代后,在培養(yǎng)基中摻入10μmol/L的Brdu,培養(yǎng)3天

11、后消化收集,無菌生理鹽水重懸,300萬/ml。每只大鼠經(jīng)尾靜脈注射ADSCs3×106,模型組輸入生理鹽水1ml。
　　 4、移植細(xì)胞后第10天開始,連續(xù)5天對(duì)各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。HE染色觀察大鼠海馬區(qū)椎體細(xì)胞形態(tài),TLINEL免疫組化染色觀察大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞的凋亡指數(shù)。
　　 5、雌鼠分別在實(shí)驗(yàn)前48h和4h皮下注射苯甲酸雌二醇200μg/kg和黃體酮2mg/kg以誘導(dǎo)雌鼠發(fā)

12、情,用發(fā)情的雌鼠和雄鼠進(jìn)行交配,從而對(duì)雄性進(jìn)行相關(guān)性能力研究。HE染色顯示大鼠睪丸組織精曲小管結(jié)構(gòu)變化,免疫組化及免疫熒光追蹤移植細(xì)胞；免疫組化觀察3β-HSD分泌及大鼠間質(zhì)細(xì)胞凋亡指數(shù)。放免法觀察大鼠血清睪酮含量。
　　 結(jié)果
　　 1、非特異筋膜結(jié)締組織源細(xì)胞具有長梭形、多角形的形態(tài)學(xué)特征,可以形成細(xì)胞集落,體外誘導(dǎo)可以分化成成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞。
　　 2、連續(xù)皮下注射D-gal可以模擬大鼠衰老。移植ADSC

13、s后,可以明顯提高衰老大鼠T-SOD、CuZn-SOD活性、血清IL-2水平、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù),降低MDA水平(P<0.05)；細(xì)胞治療組血清NO水平與模型組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 3、Morris迷宮顯示移植干細(xì)胞后,衰老大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力提高；TUNEL染色顯示海馬錐體細(xì)胞凋亡率降低。
　　 4、移植干細(xì)胞后同時(shí)可以改善衰老大鼠交配能力,增加交配次數(shù)和撲捉次數(shù)。細(xì)胞治療后血清睪酮含量增加,睪丸

14、間質(zhì)細(xì)胞分泌3β-HSD增多,而間質(zhì)細(xì)胞凋亡率降低。
　　 結(jié)論
　　 1、筋膜結(jié)締組織脂肪源干細(xì)胞具有長梭形、多角形的形態(tài)學(xué)特征,可以形成細(xì)胞集落,與其它組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞無明顯差別；細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)中,4代貼壁ADSCs特異性表面標(biāo)志物CD90、CD29表達(dá)率分別為90％以上,而CD49d、CD11b、CD45陰性表達(dá),而CD106弱表達(dá)陽性；該細(xì)胞經(jīng)定向誘導(dǎo)后可以成骨、成脂肪,與問充質(zhì)干細(xì)胞多向分化的功能一致。

15、可以判斷在發(fā)育成熟大鼠的筋膜結(jié)締組織中存在未分化間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2、連續(xù)頸背部皮下注射D-gal可以有效模擬亞急性衰老模型。衰老大鼠在外觀上及自由基等方面,顯示明顯衰老征象。
　　 3、靜脈移植脂肪源干細(xì)胞,可以顯著升高衰老大鼠體內(nèi)SOD含量、IL-2水平,有效降低MDA含量,同時(shí)提高胸腺和脾臟指數(shù)。
　　 4、移植脂肪源干細(xì)胞可以明顯改善衰老大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,抑制海馬錐體細(xì)胞凋亡。
　　 5

16、、移植脂肪源干細(xì)胞可以改善衰老老鼠的交配能力,促進(jìn)睪酮釋放,同時(shí)保護(hù)睪丸間質(zhì)細(xì)胞。
　　 綜上所述,本研究分別采用了細(xì)胞分離培養(yǎng)、HE染色和免疫組化等技術(shù)手段,從血清學(xué)自由基及免疫功能方面,以及空間學(xué)習(xí)記憶能力、交配能力等多方面,多角度的探討了移植脂肪源干細(xì)胞對(duì)D-gal誘導(dǎo)的亞急性衰老大鼠的作用。這是從筋膜學(xué)角度研究抗衰老機(jī)理的一個(gè)新嘗試。本研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充外源性的脂肪源干細(xì)胞可以延緩D-gal誘導(dǎo)的衰老,提高其生命質(zhì)量。從而為