復(fù)合脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的重組合神經(jīng)移植物的研制和應(yīng)用.pdf

1、周圍神經(jīng)缺損后的再生和功能恢復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱門問題。由于周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能上的特殊性，大多數(shù)情況無法直接對拉吻合，因此必須尋找一種神經(jīng)替代物來修復(fù)缺損。自體神經(jīng)移植會(huì)造成的供區(qū)的感覺障礙及神經(jīng)纖維錯(cuò)向再生的缺點(diǎn)。因此人們研究的重點(diǎn)已著眼于使用人工神經(jīng)替代物來引導(dǎo)周圍神經(jīng)再生。 近年來組織工程學(xué)的迅速發(fā)展使其在周圍神經(jīng)修復(fù)方面帶來了新的希望。組織工程化神經(jīng)的關(guān)鍵問題在于將種子細(xì)胞和神經(jīng)營養(yǎng)因子種植到三維支架材料中。但是如何

2、選擇合適的種子細(xì)胞、神經(jīng)營養(yǎng)因子和支架材料仍然是目前難以解決的問題。 本課題使用組織工程的方法，通過提取神經(jīng)再生微環(huán)境中的神經(jīng)再生相關(guān)營養(yǎng)因子并純化出其中的神經(jīng)活性成分；建立脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSC)在體內(nèi)體外環(huán)境下向雪旺細(xì)胞的誘導(dǎo)分化條件；最終以去細(xì)胞神經(jīng)為支架、復(fù)合神經(jīng)再生相關(guān)營養(yǎng)因子(NRNF)、ADMSCs制備了一種重組合神經(jīng)移植物，并用于周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)。其結(jié)果對于進(jìn)一步研究如何解決神經(jīng)組織工程中的種子細(xì)胞來

3、源和支架材料開辟新的思路，將為在臨床應(yīng)用中組織工程化人工神經(jīng)修復(fù)神經(jīng)缺損開辟一條全新的途徑，具有極其廣闊的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)分為以下四個(gè)部分： 1、神經(jīng)再生相關(guān)營養(yǎng)因子提取及活性檢測：目的提取神經(jīng)再生微環(huán)境中的神經(jīng)再生營養(yǎng)活性物質(zhì)。取York豬暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，截?cái)嗪罂p接入硅膠管中，形成神經(jīng)再生室，7d、14d、21d后吸取硅膠管內(nèi)液體，凝膠柱層析(SephacrylS-200)分離純化神經(jīng)再生液，通過PC12細(xì)胞分化試驗(yàn)和雪旺細(xì)胞

4、(SC)增殖試驗(yàn)檢測所提取的NRNF的生理活性。結(jié)果顯示凝膠層析分離神經(jīng)再生室內(nèi)液體可得到1＃、2＃2個(gè)峰，經(jīng)檢測2＃蛋白峰可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞伸出突起和促進(jìn)SC增殖。 2、ADMSC的體外培養(yǎng)及向雪旺細(xì)胞的分化誘導(dǎo)：目的是建立一種體外分離和培養(yǎng)大鼠ADMSC的方法并誘導(dǎo)其向雪旺細(xì)胞分化。無菌技術(shù)下切取雙側(cè)腹股溝脂肪墊，Ⅰ型膠原酶消化，接種入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)并測定其生長曲線。使用誘導(dǎo)液和NRNF誘導(dǎo)其向雪旺細(xì)

5、胞分化。結(jié)果原代培養(yǎng)顯示培養(yǎng)的ADMSC在12h左右開始貼壁，7d左右可達(dá)90％融合。CD29及CD44免疫組化為陽性表達(dá)。誘導(dǎo)后的ADMSC具有雪旺細(xì)胞的表型，可表達(dá)S100，GFAP。 3、去細(xì)胞神經(jīng)支架的制備：制備去細(xì)胞神經(jīng)支架并評測其生物相容性。方法：將豬肋間神經(jīng)、坐骨神經(jīng)使用低滲、-80℃反復(fù)凍融和NaOH裂解等方法制備去細(xì)胞神經(jīng)異體移植物；光、電鏡觀察其結(jié)構(gòu)特征；使用細(xì)胞毒性試驗(yàn)、皮下植入試驗(yàn)來評價(jià)去細(xì)胞神經(jīng)異體移植

6、物的生物相容性。結(jié)果：正常豬的周圍神經(jīng)經(jīng)過去細(xì)胞方法處理后，清除了雪旺細(xì)胞、神經(jīng)外膜和束膜的細(xì)胞，以及神經(jīng)纖維的髓鞘和軸突，保存了由雪旺細(xì)胞基底膜管以及神經(jīng)外膜和束膜的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的三維支架結(jié)構(gòu)。生物相容性測試結(jié)果顯示去細(xì)胞神經(jīng)異體移植物細(xì)胞毒性試驗(yàn)為1級，SD大鼠皮下植入試驗(yàn)無明顯的免疫排斥反應(yīng)。 4、復(fù)合ADMSC的重組合神經(jīng)移植物的制備及用于周圍神經(jīng)缺損修復(fù)：使用NRNF+誘導(dǎo)后的ADMSC復(fù)合于膠原凝膠中，注入去細(xì)胞神

7、經(jīng)支架中來制備重組合神經(jīng)移植物。周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)分為四組來修復(fù)SD大鼠10mm坐骨神經(jīng)缺損：A組復(fù)合ADMSC的重組合神經(jīng)移植物；B組誘導(dǎo)后的ADMSC+去細(xì)胞神經(jīng)支架；C組NRNF+去細(xì)胞神經(jīng)支架材料；D組去細(xì)胞神經(jīng)支架材料；E組：自體神經(jīng)移植組。修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損16周后，通過電鏡、免疫組化、圖像分析、電生理、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定進(jìn)行神經(jīng)再生評價(jià)。結(jié)果顯示A組修復(fù)效果與自體神經(jīng)移植組E接近，修復(fù)效果優(yōu)于其它組；B、C組次之，

8、單純使用去細(xì)胞神經(jīng)支架效果最差。 5、長距離神經(jīng)缺損的修復(fù)：復(fù)合脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的重組合神經(jīng)移植物用于修復(fù)長距離神經(jīng)缺損的可行性。使用復(fù)合脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的重組合神經(jīng)移植物修復(fù)狗30mm的坐骨神經(jīng)缺損，術(shù)后6個(gè)月通過電鏡、免疫組化、圖像分析、電生理方法神經(jīng)再生評價(jià)。結(jié)果顯示30mm坐骨神經(jīng)缺損已經(jīng)成功修復(fù)。 通過以上研究得出以下結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)所制備的神經(jīng)再生營養(yǎng)因子具有一定的神經(jīng)營養(yǎng)功能，可以考慮作為神經(jīng)損傷修