miRNA-558對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中肝素酶表達(dá)的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述:
　　第一部分:神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞中miR-558上調(diào)與HPSE表達(dá)水平呈正相關(guān)
　　目的：探討miR-558、HPSE在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平及二者的關(guān)聯(lián)性。
　　方法：通過miRNA–promoter interaction database和 AGO–chromosome interaction profiling data(GSE40536)軟件預(yù)測AGO蛋白富

2、集的HPSE啟動(dòng)子區(qū)域所能結(jié)合的miRNAs；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測到的miRNAs對(duì)HPSE啟動(dòng)子活性的影響；通過R2數(shù)據(jù)庫檢索miR-558宿主基因BIRC6(baculoviral IAP repeat containing6)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平；實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測30例NB標(biāo)本、正常脊髓背根神經(jīng)節(jié)和培養(yǎng)的SK-N-SH、SK-N-AS、SH-SY5Y和SK-N-BE(2)細(xì)胞系中成熟miR-5

3、58水平；Western blot assay進(jìn)一步驗(yàn)證HPSE的表達(dá)水平及其與miR-558的關(guān)系。
　　結(jié)果：AGO1富集于HPSE轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)上游?2468/?2591 bp區(qū)域，該區(qū)域存在miR-145、miR-558和miR-17的結(jié)合位點(diǎn)，分別位于HPSE TSS上游2330/2345、2314/2332和2292/2313bp的位置；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染miR-558 inhibitor和mimic能導(dǎo)致

4、HPSE啟動(dòng)子活性分別降低、增高，而miR-145或 miR-17對(duì)啟動(dòng)子活性沒有影響；R2數(shù)據(jù)庫分析表明：與正常背根神經(jīng)節(jié)相比，BIRC6的表達(dá)在88例NB組織中是上調(diào)的(P<0.0001)。此外，BIRC6的水平與 International Neuroblastoma Staging System(INSS)分期(P=0.007)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤的侵襲性(P=0.0079)相關(guān)聯(lián)；qRT-PCR檢測表明：與正常背根神經(jīng)節(jié)比較，成熟m

5、iR-558在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)；Western blot檢測表明HPSE在NB組織和細(xì)胞系中高表達(dá)。在NB組織和細(xì)胞系中，miR-558的表達(dá)與HPSE的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)(R=0.633, P<0.0001)。在低分化(P=0.0001)的 NB組織中，觀察到更高的 miR-558表達(dá)或更高的 HPSE蛋白水平(P=0.0011)。
　　結(jié)論：在NB組織和細(xì)胞系中，神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化程度越低，miR-558和HPSE

6、表達(dá)量越多，miRNA可以調(diào)節(jié)HPSE的轉(zhuǎn)錄，且miR-558上調(diào)與 HPSE的表達(dá)水平呈正相關(guān)。
　　第二部分:miR-558促進(jìn)HPSE表達(dá)的機(jī)制研究
　　目的：研究miR-558是在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平促進(jìn) HPSE的表達(dá)。
　　方法：分別進(jìn)行了miRNA-558敲低和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)：anti-miR-558 inhibitor轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞后，qRT-PCR及Western blot檢測HPSE、VEGF新

7、生轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平；過表達(dá)miR-558后，RT-PCR及Western blot檢測HPSE、VEGF在NB細(xì)胞中的表達(dá)情況；通過 miRNA–啟動(dòng)子相互作用數(shù)據(jù)庫檢索在 HPSE的3′-UTR有無miR-558的結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)果：敲低miRNA-558導(dǎo)致SH-SY5Y和SK-N-BE(2)細(xì)胞中HPSE、VEGF新生轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平下降；miR-558穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系檢測的結(jié)果是相反的。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，敲低或過表達(dá)m

8、iR-558對(duì)VEGF3’-UTR和HPSE3'-UTR的雙熒光素酶活性無影響，表明miR-558不參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
　　結(jié)論：在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，miR-558通過轉(zhuǎn)錄激活進(jìn)而促進(jìn)HPSE的表達(dá)，并通過HPSE調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，miR-558不參與HPSE的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
　　第三部分:miR-558通過靶向HPSE促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞體外生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成活性
　　目的：通過敲低和過表達(dá) miRNA-558，

9、研究其對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生物學(xué)功能（生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成）的影響，通過回補(bǔ)HPSE進(jìn)一步研究對(duì)生物學(xué)功能的改變。
　　方法：通過轉(zhuǎn)染miR-558質(zhì)粒，建立穩(wěn)定表達(dá)miRNA-558的SH-SY5Y、SK-N-SH細(xì)胞系。MTT比色法和軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢測敲低或過表達(dá)miR-558對(duì)腫瘤細(xì)胞生存與生長能力的影響；劃痕遷移實(shí)驗(yàn)檢測敲低或過表達(dá)miR-558對(duì)NB細(xì)胞遷移能力的影響；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染敲低或過表達(dá)mi

10、R-558后，NB細(xì)胞侵襲能力的改變；轉(zhuǎn)染了敲低miR-558或過表達(dá)miR-558的NB細(xì)胞上清被用來進(jìn)行血管形成實(shí)驗(yàn)；分別過表達(dá)和敲低HPSE回補(bǔ)HPSE的水平，進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)， Western blot檢測HPSE和VEGF的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染HPSE可以回補(bǔ)miR-558敲低所引起的HPSE和VEGF的下調(diào)。MTT比色法和軟瓊脂實(shí)驗(yàn)表明：anti-miR-558 inhibitor轉(zhuǎn)染

11、的腫瘤細(xì)胞生存與生長能力降低；在劃痕遷移實(shí)驗(yàn)中，anti-miR-558 inhibitor抑制SH-SY5Y和 SK-N-BE(2)細(xì)胞的遷移能力；Transwell實(shí)驗(yàn)表明：轉(zhuǎn)染了anti-miR-558 inhibitor的NB細(xì)胞相對(duì)于轉(zhuǎn)染anti-NC的細(xì)胞而言，侵襲能力減弱；用 anti-miR-558 inhibitor轉(zhuǎn)染的NB細(xì)胞的上清預(yù)處理基質(zhì)膠后，內(nèi)皮細(xì)胞血管形成受抑制；另一方面，miR-558過表達(dá)的作用是相反的

12、；而且，通過轉(zhuǎn)染HPSE或HPSE siRNA恢復(fù)HPSE的表達(dá)可以回補(bǔ)這些生物學(xué)功能的改變。同時(shí)，恢復(fù)VEGF的水平只能部分抑制NB細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-558所引起的生長、遷移、侵襲和血管生成等生物學(xué)特征的改變。
　　結(jié)論：miR-558通過靶向HPSE顯著促進(jìn)NB細(xì)胞的體外生長、遷移，侵襲和血管生成。
　　第四部分:敲低miR-558抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移和血管生成
　　目的：研究敲低miRNA-558對(duì)

13、腫瘤體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移和血管形成的影響。
　　方法：經(jīng)尾靜脈注射anti-miR-558 inhibitor觀察對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞建立的皮下種植瘤裸鼠模型的影響，記錄瘤體的體積及重量；裸鼠體表瘤體行免疫組織化學(xué)染色檢測CD31-陽性微血管和平均血管密度；鼠尾轉(zhuǎn)移模型的肺組織行HE染色檢測轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目。
　　結(jié)果：與anti-NC處理組相比，anti-miR-558 inhibitor組裸鼠皮下種植瘤的腫瘤體積和重量都是下降的；