靶向CD19的嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞(CD19-CAR-T)構(gòu)建及其對(duì)CD19陽(yáng)性血液腫瘤細(xì)胞的殺傷研究.pdf

1、研究目的：
　　隨著基因編輯技術(shù)的逐步發(fā)展，過(guò)繼性免疫治療(Adoptive cellular therapy，ACT)在腫瘤生物治療中占據(jù)著越來(lái)越重要的作用。由于諸多限制，以往的過(guò)繼免疫治療并未產(chǎn)生持續(xù)、明顯的抗瘤作用。但是一種新的過(guò)繼性免疫療法--嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)的發(fā)展極大的增強(qiáng)了過(guò)繼性免疫治療的治療效果，其突出優(yōu)點(diǎn)是可以克服MHC限制性。
　　CD19抗原特異性

2、表達(dá)于B淋巴細(xì)胞及B系血液腫瘤細(xì)胞表面，在正常的造血干細(xì)胞表面不表達(dá)，是CAR-T治療B系血液腫瘤的研究熱點(diǎn)。本課題以pcDNA?3.1(+)為質(zhì)粒載體，使用小鼠抗人CD19單抗（克隆號(hào)：FMC63）為胞外單克隆抗體單鏈可變區(qū)序列，以CD137為共刺激分子，T細(xì)胞受體(TCR)/ CD3的-δ鏈作為胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域來(lái)構(gòu)建第二代嵌合抗原受體。同時(shí)采用不同培養(yǎng)方法來(lái)培養(yǎng)構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞，觀察不同培養(yǎng)條件下的構(gòu)建CAR-T表達(dá)效率，然后使用

3、培養(yǎng)的CD19-CAR-T細(xì)胞殺傷CD19陽(yáng)性血液腫瘤細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞，觀察殺傷性細(xì)胞因子的分泌及其靶向性殺傷作用，對(duì)CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)外抗CD19陽(yáng)性血液腫瘤的作用進(jìn)行初步研究。
　　研究方法：
　　確定CD19單抗的單鏈可變區(qū)片段、CD137共刺激分子及CD3-δ鏈序列，使用基因工程方法將其整合成一個(gè)整體序列，即CD19-CAR。然后將CD19-CAR片段克隆到慢病毒載體pcDNA?3.1(+)上，選用的插入酶切位點(diǎn)是N

4、heI/BamHI。然后將穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)和pcDNA?3.1(+)目的質(zhì)粒共培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，制備成慢病毒，使用DNA測(cè)序及流式檢測(cè)構(gòu)建慢病毒序列是否正確。進(jìn)而使用慢病毒對(duì)活化T細(xì)胞進(jìn)行感染，使用加有IL-15或不加IL-15的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CD19-CAR-T細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD19-CAR-T細(xì)胞的生長(zhǎng)表達(dá)情況、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　DNA

5、測(cè)序表明慢病毒基因序列構(gòu)建正確，通過(guò)熒光顯微鏡及稀釋倍數(shù)測(cè)定制備的慢病毒滴度約為2×108TU/ml。轉(zhuǎn)染慢病毒后（本身表達(dá)EGFP）的T細(xì)胞加Fc-APC抗體檢測(cè)，EGFP熒光/ Fc-APC雙陽(yáng)性，流式結(jié)果表明CD19-CAR-構(gòu)建成功可以在細(xì)胞膜表面表達(dá)。加入低濃度的IL-15的CAR-T表達(dá)率為45％，未加入IL-15的CAR-T表達(dá)率為9%。CD19-CAR-T細(xì)胞與293T細(xì)胞共培養(yǎng)后IL-2、TNF-α殺傷細(xì)胞因子分泌量分