針對白蛋白及CD19的新型核酸適配體的篩選.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 針對白蛋白的新型核酸適配體的篩選和鑒定
　　目的:蛋白質組學是研究和發(fā)現(xiàn)疾病生物標志物的重要技術手段。然而，由于許多重要的生物標志物都是低豐度蛋白，分析時會受到樣品其他高豐度蛋白的影響，降低蛋白質組學方法的靈敏度，使檢測面臨困難。白蛋白在體內可占到血漿蛋白總量的80％以上，同時也廣泛存在于其他體液中，比如腦脊液、尿液、唾液和淚液等。因此在進行體液蛋白質組的分析過程中，有時在分析

2、前要將白蛋白去除，以提高蛋白鑒定的深度，鑒定出更多的蛋白生物標志物。目前，去除白蛋白的手段主要基于抗體技術。但抗體價格較高且有時存在穩(wěn)定性問題，一定程度上限制了其廣泛應用，因此有必要探索去除白蛋白的新技術。除抗體外，核酸適配體(Aptamer)也可識別蛋白。核酸適配體是短的單鏈DNA或RNA分子，可以折疊成復雜的空間結構，以較高的親和力和特異性結合靶標分子。與抗體相比，核酸適配體結構穩(wěn)定，容易修飾，合成成本低，因此有望成為良好的抗體替代

3、物。目前，針對白蛋白的核酸適配體尚未見報道。本研究旨在篩選針對白蛋白的核酸適配體，為研發(fā)去除白蛋白的新技術提供基礎。
　　方法:以白蛋白作為靶標，通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(SELEX)篩選一種能夠以較好的親和性和特異性結合白蛋白的核酸適配體;利用流式細胞術對篩選進程進行監(jiān)測，并檢測篩選到的核酸適配體與靶標白蛋白以及對照蛋白(免疫球蛋白IgG、胰蛋白酶trypsin、卵清蛋白ovalbumin)的結合情況，對其結合靶標的能力進

4、行評估。
　　結果:(1)篩選到一種能與白蛋白結合的DNA核酸適配體A6，長度為59個堿基。其一級序列為5'-TGCGTGTGTAGTGTGTCTGCGCTGTTCTATGCCTTCGGCGCTCTTAGGGATTTGGGCGG-3，(2)該核酸適配體與白蛋白結合能力較強，親和系數(shù)為77.4nmol/L。(3)該核酸適配體的特異性較好，與免疫球蛋白(IgG)、胰蛋白酶(Trypsin)、卵清蛋白(Ovalbumin)的交叉結合相對

5、較弱。
　　結論:本研究篩選出了一種針對白蛋白的核酸適配體A6，該核酸適配體與靶標結合的親和力良好，且與其他蛋白的結合相對較低。相對于抗體，A6作為一種核酸適配體具有合成簡便、價格低廉等優(yōu)點，有望在去除白蛋白的新方法中發(fā)揮作用。
　　第二部分 新型CD19核酸適配體的篩選
　　目的:淋巴瘤(Lymphoma)是一種發(fā)病率逐年上升的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來，淋巴瘤的靶向治療越來越受到關注，因為相比于傳統(tǒng)的放療與化療，靶向

6、治療在發(fā)揮藥物療效的同時還可減輕藥物對正常組織和細胞的損傷。CD19是高表達于B細胞淋巴瘤的分子，是治療淋巴瘤的重要靶點。淋巴瘤分為兩大類，包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma，NHL)，而大多數(shù)的NHL為B細胞來源的腫瘤，高表達CD19。靶向治療需要靶向分子，核酸適配體(Aptamer)是一種具有較大應用潛能的新型靶向分子。核酸適配體在結構上是由短

7、鏈DNA或RNA分子構成，它可以通過自身的折疊形成復雜的空間結構，如發(fā)卡、莖環(huán)結構等，以較高的親和力和特異性結合靶標。相比于抗體，核酸適配體一個較大的優(yōu)勢是價格相對低廉，可化學合成，并在體外進行大量生產。除此之外，核酸適配體還具有免疫原性低、易于修飾、能夠耐受高溫以及酸堿環(huán)境、不同生產批次間質量較為穩(wěn)定等優(yōu)勢，這使其有望成為一種相對理想的靶向分子。目前，文獻中尚未見關于CD19的核酸適配體的研究工作。本課題篩選了第一個能夠結合CD19的

8、DNA核酸適配體，在體外評估了其與CD19陽性淋巴瘤細胞的結合特性，并且構建了核酸適配體-阿霉素(Apt-dox)復合體，評估了該復合體對CD19陽性淋巴瘤細胞的靶向殺傷作用。
　　方法:以CD19蛋白作為靶標，用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(SELEX)篩選能與CD19蛋白結合的核酸適配體。用流式細胞儀分別檢測適配體與CD19蛋白，白蛋白、卵清蛋白的結合，及與CD19陽性淋巴瘤細胞（Ramos細胞和Raji細胞）和CD19陰性細胞

9、（Jurkat細胞和NB-4細胞）的結合。利用共聚焦顯微鏡對核酸適配體與這四種細胞結合的情況進行觀察。將阿霉素嵌入適配體結構中構建Apt-dox復合體，并利用阿霉素熒光光譜評估復合體構建情況。利用共聚焦顯微鏡評估CD19陽性細胞和陰性對照細胞對Apt-dox復合體的攝取。應用MTS法檢測Apt-dox復合體對CD19陽性細胞以及陰性細胞的殺傷作用。
　　結果:(1)所篩選到的針對CD19的核酸適配體L7，長度為59個堿基，經測序分

10、析，其一級序列為5'-TGCGTGTGTAGTGTGTCTGTTCTCCTTTTTTTGGTTGCTGCTCTTAGGGATTTGGGCGG-3'(2)核酸適配體L7可與CD19蛋白以較高的親和力結合，親和力數(shù)為85.4 nmol/L，且與白蛋白、卵清蛋白等交叉結合較弱。(3)核酸適配體L7能夠識別CD19陽性的淋巴瘤細胞Ramos和Raji，但基本不與CD19陰性的細胞Jurkat和NB4細胞結合。(4)該Apt-dox復合體能夠攜帶

11、阿霉素進入CD19陽性淋巴瘤細胞，并降低藥物在CD19陰性細胞中的攝取。(5)Apt-dox復合體可保持阿霉素對CD19陽性淋巴瘤細胞的殺傷作用，但顯著降低了CD19陰性細胞的殺傷。
　　結論:本研究篩選到了首個針對CD19的DNA核酸適配體L7。該適配體能夠以較高的親和力和特異性結合CD19蛋白，識別CD19陽性的淋巴瘤細胞，且與其他蛋白和陰性細胞的交叉結合較弱。該核酸適配體與阿霉素構建的復合體(Apt-dox)可以選擇性地將阿