靶向間皮素的嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞治療卵巢癌實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、癌癥已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了人類的健康，對人類的生存造成了極大的危害。在全球范圍內(nèi)，卵巢癌占婦科最常見癌癥的第八位，且死亡人數(shù)占婦科常見腫瘤的第七位。每年全世界約有230000名婦女被診斷為卵巢癌，而且超過75％的患者確診時(shí)已經(jīng)是晚期，卵巢癌的5年生存率低于45％。目前臨床上卵巢癌常見的治療手段包括手術(shù)、放化療等，但這些治療不能有效的控制腫瘤的復(fù)發(fā)及進(jìn)展，也不能有效的延長患者的生存期及改善患者的生存質(zhì)量。因此我們迫切需要尋求新的治療手段。近年來

2、生物治療成為一種重要的抗腫瘤治療手段，給攻克惡性腫瘤帶來了希望。
　　研究表明大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞能夠躲避免疫系統(tǒng)的識別，從而限制免疫治療的抗癌效果。CAR-T（嵌合抗原受體T細(xì)胞）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其具有較好的靶向性、殺傷性、增殖性及持久性。大量的臨床試驗(yàn)研究也表明該技術(shù)在改善惡性血液腫瘤患者生存質(zhì)量及延長患者生存期方面取得了巨大的成功，CAR-T技術(shù)成為了免疫治療的研究熱點(diǎn)。然而該技術(shù)在實(shí)體腫瘤的研究還不夠成熟，未能得到期待的效果，仍

3、然面臨許多問題，包括:實(shí)體瘤組織特殊的病理學(xué)特征、表面缺乏合適的腫瘤特異性抗原，腫瘤周圍免疫抑制微環(huán)境、共刺激分子的優(yōu)化組合、自殺基因的設(shè)計(jì)、回輸后的不良反應(yīng)等。本課題構(gòu)建并檢測了靶向間皮素抗原的嵌合抗原受體T細(xì)胞對幾種卵巢癌細(xì)胞株的體外殺傷作用:
　　1、構(gòu)建包含兩個(gè)胞內(nèi)共刺激區(qū)（CD3ζ和4-1BB）的mesoCAR的重組質(zhì)粒，再通過piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，獲得第二代mesoCAR-T細(xì)胞。其轉(zhuǎn)染效率為30％左右

4、。進(jìn)一步證明mesoCAR能夠在T細(xì)胞中高水平穩(wěn)定表達(dá)。流式檢測經(jīng)過間皮素刺激后mesoCAR-T的活化表型的表達(dá)情況，結(jié)果表明間皮素抗原能使mesoCAR-T細(xì)胞活化。
　　2、通過流式及Westem Blot檢測多種腫瘤細(xì)胞株間皮素的表達(dá)水平，篩選出五種間皮素不同表達(dá)水平的卵巢癌細(xì)胞株。通過不同的方式檢測mesoCAR-T細(xì)胞對間皮素高表達(dá)的細(xì)胞株及低表達(dá)的細(xì)胞株的殺傷作用。結(jié)果顯示mesoCAR-T細(xì)胞對間皮素高表達(dá)細(xì)胞株的

5、殺傷作用明顯強(qiáng)于低表達(dá)的細(xì)胞株，并且能更有效的抑制間皮素高表達(dá)細(xì)胞株的生長。表明構(gòu)建的mesoCAR-T細(xì)胞對間皮素高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞株具有更強(qiáng)的殺傷活性及靶向性。
　　3、構(gòu)建靶向間皮素抗原的嵌合抗原受體T細(xì)胞(mesoCAR-T)，通過流式檢測間皮素抗原刺激后mesoCAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的分泌量明顯高于對照組T細(xì)胞。同時(shí)用流式檢測mesoC

6、AR-T細(xì)胞與兩種卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞因子的分泌，發(fā)現(xiàn)MesoCAR-T細(xì)胞與間皮素高表達(dá)的細(xì)胞株(HO8910)共培養(yǎng)后，IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及IFN-γ的分泌量相比間皮素低表達(dá)的細(xì)胞株(SKOV3)升高。
　　本實(shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建了靶向間皮素抗原的嵌合抗原受體T細(xì)胞(mesoCAR-T)，其結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的piggyBac轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)能夠很好的將外源基因整合T細(xì)胞中，并且構(gòu)建的mesoCAR-