花青素對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞MCP-1、ICAM-1、TGF-β1和NF-κB表達(dá)的影響及機(jī)制.pdf

1、目的:糖尿病腎疾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一，也是慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)引起死亡的主要原因。腎小管損傷、腎小球硬化、腎間質(zhì)炎癥均是糖尿病腎疾病進(jìn)程中的重要病理變化。目前關(guān)于防止糖尿病腎疾病的發(fā)生，抑制糖尿病腎疾病的發(fā)生發(fā)展，保護(hù)腎功能仍需進(jìn)一步的研究。
　　大量研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體-α(peroxisomepr

2、oliferators activated receptor-α，PPAR-α)可以增加巨噬細(xì)胞中肝臟X受體α(liver X-activated receptor-α，LXR-α)的表達(dá)，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中有重要作用。除此之外，PPAR-α和LXR-α在許多炎性和代謝性疾病中表現(xiàn)出抗炎作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-α激活劑非諾貝特能夠通過抑制NF-κB活性和促炎細(xì)胞因子細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular cell adhe

3、sion molecule-1，ICAM-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattratctant protein-1，MCP-1)的產(chǎn)生來改善炎癥。激活LXR-α還能夠抑制促炎細(xì)胞因子MCP-1，ICAM-1和TGFβ-1的產(chǎn)生。因此，作為生理調(diào)節(jié)劑，PPAR-α和LXR-α位于脂質(zhì)代謝和炎癥的交叉點(diǎn)。
　　許多

4、研究表明，花青素(anthocyanidin)是一類廣泛存在于植物中的天然色素，具有很強(qiáng)的降血糖、降血脂、抗凋亡、防癌等作用?；ㄇ嗨卦谔悄虿?dòng)物模型中表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗氧化性質(zhì)，并且對(duì)高血糖誘導(dǎo)的腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用。前期的研究表明，花青素能夠作用于糖尿病狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)通路，從而緩解糖尿病腎病發(fā)生時(shí)腎臟脂質(zhì)沉積。也有研究表明花青素具有抗炎作用，紫色玉米中花青素通過NF-κB依賴性機(jī)制阻止高糖誘導(dǎo)的腎小球硬化和腎纖維化。以上研究

5、提示:花青素可能抑制DKD發(fā)病過程中炎癥因子的分泌，從而改善炎癥因子引起的腎損傷。
　　在本研究中我們利用HK-2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分組干預(yù)刺激24或48小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。觀察花青素對(duì)高糖刺激的HK-2細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子分泌的作用及其作用機(jī)制。
　　方法:HK-2細(xì)胞在5％ CO2，37℃ CO2培養(yǎng)箱中，以含有10％胎牛血清的低糖型DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將LXR-α

6、-shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人腎小管上皮HK-2細(xì)胞，經(jīng)G418（0.3mg/ml）篩選穩(wěn)定的細(xì)胞系。HK-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至75％～85％融合后，用無血清培養(yǎng)基同步24 h。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組如下:正常糖組(5.6mmol/L葡萄糖，NG)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖，HG)、高糖+ C3G組(30 mmol/L葡萄糖+50μmol/L cyanidin-3-O-β-glucoside chloride，HG+C3G)，高糖+Cy組(3

7、0 mmol/L葡萄糖+50μmol/L cyanidin chloride，HG+Cy)，高糖+GW6471組(30 mmol/L葡萄糖+25μmol/L GW6471，HG+GW6471)，高糖+LXR-α-shRNA組(30 mmol/L葡萄糖+LXR-α-shRNA，HG+LXR-α-shRNA)，于分組干預(yù)刺激24或48小時(shí)后收集細(xì)胞;MTT檢測(cè)細(xì)胞活力;Western blot檢測(cè)LXR-α，PPAR-α，NF-κB，MCP

8、-1，ICAM-1和TGF-β1蛋白表達(dá);Real-time PCR檢測(cè)LXR-α，PPAR-α，MCP-1，ICAM-1和TGF-β1 mRNA表達(dá);ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中MCP-1，ICAM-1和TGF-β1蛋白表達(dá);免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)HK-2細(xì)胞中NF-κB表達(dá)。
　　結(jié)果:1.花青素對(duì)HK-2細(xì)胞活力的影響。
　　細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)(MTT)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯受抑;與高糖組相比，高糖+花

9、青素(HG+C3G或Cy)組細(xì)胞活性受到明顯抑制，這說明花青素對(duì)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞活力有影響。
　　2.花青素對(duì)高糖刺激的HK-2細(xì)胞中MCP-1，ICAM-1和TGF-β1表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清中MCP-1，ICAM-1和TGF-β1表達(dá)明顯增加;與高糖組相比，高糖+花青素(HG+C3G或Cy)組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清中MCP-1，ICAM-1和TGF-β1表達(dá)明顯減少，

10、這說明花青素可抑制高糖刺激的HK-2細(xì)胞中促炎癥細(xì)胞因子的分泌。
　　3.花青素對(duì)高糖刺激的HK-2細(xì)胞中NF-κB表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞中NF-κB出現(xiàn)明顯的胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)移;與高糖組相比，高糖+花青素(HG+ C3G或Cy)組細(xì)胞中NF-κB胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)移減少，這說明花青素可抑制高糖刺激的HK-2細(xì)胞中NF-κB胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)移。
　　4.花青素對(duì)高糖刺激的HK-2細(xì)胞中PPAR-

11、α和LXR-α水平的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞中PPAR-α和LXR-α表達(dá)明顯增加;與高糖組相比，高糖+花青素(HG+C3G或Cy)組細(xì)胞中PPAR-α和LXR-α表達(dá)明顯減少，這說明花青素可抑制高糖刺激的HK-2細(xì)胞中PPAR-α和LXR-α表達(dá)。
　　5.抑制PPAR-α和LXR-α對(duì)高糖刺激的HK-2細(xì)胞中MCP-1，ICAM-1和TGF-β1表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)

12、照組相比，高糖組細(xì)胞中MCP-1，ICAM-1和TGF-β1表達(dá)明顯增加;與高糖組相比，高糖+GW6471(HG+GW6471)組細(xì)胞中MCP-1，ICAM-1和TGF-β1表達(dá)無明顯減少，而高糖+LXR-α-shRNA(HG+LXR-α-shRNA)組細(xì)胞中MCP-1，ICAM-1和TGF-β1表達(dá)明顯減少，這說明花青素抑制高糖刺激的HK-2細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的分泌可能是通過抑制LXR-α實(shí)現(xiàn)的。
　　6.抑制LXR-α對(duì)高糖刺

13、激的HK-2細(xì)胞中NF-κB表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞核中NF-κB出現(xiàn)明顯的胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)移;與高糖組相比，高糖+LXR-α-shRNA(HG+LXR-α-shRNA)組細(xì)胞中NF-κB無明顯的胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)移，這說明花青素抑制高糖刺激的HK-2細(xì)胞中NF-κB表達(dá)可能是通過抑制LXR-α實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論:1.花青素能夠影響高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞的活力。
　　2.花青素抑制高糖誘導(dǎo)的H