Apelin對(duì)葡萄糖毒性作用及胰島細(xì)胞PDX-1蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的:1.探討Apelin是否通過參與葡萄糖毒性作用機(jī)制引起胰島素釋放減少。2.研究Apelin與PDX-1蛋白合成的關(guān)系。
　　方法:復(fù)蘇并培養(yǎng)好的胰島β細(xì)胞株小鼠NIT-1細(xì)胞接種于25ml培養(yǎng)瓶（1×107cells/瓶），在各不同濃度葡萄糖的含血清RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天。隨機(jī)分組如下:(1)正常對(duì)照組1:葡萄糖的濃度為5.6 mmol/L。(2)正常對(duì)照組2:葡萄糖的濃度為5.6mmol/L+Apelin-36(

2、1μmol/L)。(3)高糖組1:葡萄糖的濃度為16.7mmol/L。(4)高糖組2:葡萄糖的濃度為16.7mmol/L+Apelin-36(1μ mol/L)。(5)極高糖組1:葡萄糖的濃度為33.3mmol/L。(6)極高糖組2:葡萄糖的濃度為33.3mmol/L+Apelin-36(1μ mol/L)。然后進(jìn)行:1.基礎(chǔ)Ins釋放試驗(yàn):將各組胰島β細(xì)胞移到1 ml離心管(1×106cells/管)中，預(yù)孕育在HBSS液（37℃孕育

3、60分鐘）中，用PBS洗滌2次后，在含葡萄糖濃度為5.6 mmol/L的HBSS緩沖液中37℃預(yù)孕育60min，棄掉緩沖液，然后將細(xì)胞置于1 ml含葡萄糖濃度為5.6mmol/L（基礎(chǔ)）和葡萄糖濃度為16.7mmol/L（葡萄糖刺激）的HBSS緩沖液中37℃育1h，收集反應(yīng)液，然后用ELISA法測(cè)定Ins含量。2.細(xì)胞內(nèi)Ins含量測(cè)定:取各組培養(yǎng)好的小鼠NIT-1細(xì)胞到1ml離心管（1×106cells/管），進(jìn)行反復(fù)的冷凍溶解破碎然后

4、以酸化乙醇溶液進(jìn)行抽提，4℃孵育16～24 h，用ELISA法測(cè)定Ins含量。3.PDX-1蛋白的表達(dá):收集各組NIT-1細(xì)胞進(jìn)行涂片，用4％的多聚甲醛溶液固定20 min，PBS沖洗3次每次3min，按照S/P免疫組化試劑盒的說明書進(jìn)行操作。在顯微鏡下計(jì)算各組細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。4.PDX-1mRNA的表達(dá):取各組新鮮的小鼠NIT細(xì)胞涂片，用4％多聚甲醛/0.1％DEPC/0.1mmol/L PBS(pH7.2～7.6)固定20～30m

5、in，按照PDX-1原位雜交試劑盒的說明書進(jìn)行操作，在顯微鏡下計(jì)算各組細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)果:①與正常組1比較，高糖組1和極高糖組1的基礎(chǔ)和刺激后胰島素分泌、細(xì)胞內(nèi)胰島素均明顯減少(P＜0.05);②加Apelin的正常組2的基礎(chǔ)和刺激后胰島素分泌、細(xì)胞內(nèi)胰島素與正常組1相比，無(wú)明顯差異(P＞0.05);③加Apelin的高糖組2和極高糖組2的細(xì)胞內(nèi)胰島素、基礎(chǔ)和刺激后胰島素分泌分別較高糖組1和極高糖組1明顯下降(P＜0.0

6、5);④與正常組1比較，高糖組1和極高糖1的PDX-1蛋白表達(dá)下降(P＜0.05);⑤加Apelin的正常組2的PDX-1蛋白表達(dá)與正常組1相比，無(wú)明顯差異(P＞0.05);⑥加Apelin的高糖組2和極高糖組2的PDX-1蛋白表達(dá)分別較高糖組1和極高糖組1明顯下降(P＜0.05);⑦各濃胰島素水平與PDX-1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與PDX-1mRNA表達(dá)無(wú)關(guān);⑧各組間PDX-1mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論