NID1通過(guò)EMT促進(jìn)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、卵巢癌是惡性程度最高的婦科腫瘤，缺乏早期診斷標(biāo)志物、容易早期轉(zhuǎn)移擴(kuò)散以及耐受化療藥物是造成卵巢癌死亡-發(fā)病率（death-incidence ratio）高的重要因素。深入研究卵巢癌發(fā)生發(fā)展尤其是侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，并由此制定有效的分子診斷方法與靶向治療策略，對(duì)于提高卵巢癌的診治水平并降低死亡率具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。NID1（Nidogen-1）是我們?cè)谇捌诼殉舶┑鞍踪|(zhì)組研究中篩選并驗(yàn)證的可輔助卵巢癌診斷的候選血漿蛋白標(biāo)志物之一，它

2、在卵巢癌患者血漿中的蛋白水平顯著升高，與其它候選蛋白進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)可進(jìn)一步提高診斷靈敏性和特異性。另外，NID1在攜帶淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者血漿和腫瘤組織中的水平均高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者。NID1作為細(xì)胞外基質(zhì)特化結(jié)構(gòu)——基膜的重要成分，它在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用并不清楚。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研（“腫瘤侵襲、EMT和基膜三者存在密切關(guān)聯(lián)”）和前期臨床數(shù)據(jù)（“卵巢癌樣本中NID1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)”），我們推測(cè)NID1極可能在卵巢癌的侵襲

3、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。以此為據(jù)，本課題從以下四方面深入開(kāi)展NID1對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制的研究，以期為NID1作為候選的卵巢癌預(yù)后標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的研究?jī)r(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。
　?。?）穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NID1蛋白和瞬時(shí)敲降NID1蛋白的細(xì)胞模型的建立：采用NID1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染OVCAR-3細(xì)胞并篩選穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株（命名為OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞），采用兩種NID1-siRNA分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEY細(xì)胞獲得HEY

4、-NID1-si798細(xì)胞和HEY-NID1-si2983細(xì)胞。進(jìn)一步采用熒光定量RT-PCR和Western blot鑒定這些細(xì)胞模型，確認(rèn)OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞是穩(wěn)定高表達(dá)NID1蛋白的細(xì)胞模型，而HEY-NID1-si798和HEY-NID1-si2983細(xì)胞是瞬時(shí)敲降NID1蛋白的細(xì)胞模型。
　?。?）NID1對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響：劃痕實(shí)驗(yàn)顯示OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞的側(cè)向遷移速度明顯快于對(duì)

5、照細(xì)胞，Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力明顯優(yōu)于OVCAR-3-vector，表明過(guò)表達(dá)NID1增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3的遷移和侵襲能力。同樣地，Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示，HEY-NID1-si798和HEY-NID1-si2983細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力弱于對(duì)照細(xì)胞，表明敲降NID1減弱卵巢癌細(xì)胞HEY遷移和侵襲能力。
　?。?）NID1對(duì)卵巢癌細(xì)胞 EMT相

6、關(guān)表型的影響：不同于對(duì)照細(xì)胞的“立方形”外形，OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞呈現(xiàn)出“梭形”外形。熒光定量RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)下降，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子（包括Vimentin和N-cadherin）和EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist-2表達(dá)表達(dá)升高。細(xì)胞免疫熒光的再次證實(shí)了OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞中Vimentin熒光信號(hào)更強(qiáng)。與之

7、相對(duì)應(yīng)，HEY-NID1-si798和HEY-NID1-si2983細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞的“梭形”相比更偏“立方形”外形，盡管 Vimentin、N-cadherin和Twist-2并沒(méi)有發(fā)生預(yù)料中的改變，但Western blot和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果均顯示兩種瞬時(shí)敲降NID1的HEY細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)都顯著升高。以上結(jié)果表明，NID1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　（4）NID1通過(guò) ERK/MAPK通路改變EMT相關(guān)分子表

8、達(dá)：Western blot結(jié)果顯示，OVCAR-3-NID1-MC細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化水平顯著高于對(duì)照細(xì)胞。經(jīng)ERK/MAPK通路的抑制劑U0126下調(diào)其ERK1/2的磷酸化水平后，E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和Twist-2表達(dá)水平出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果提示，NID1可通過(guò)ERK/MAPK通路改變卵巢癌細(xì)胞EMT相關(guān)分子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT。另外，Western blot結(jié)果顯示OVCAR-3

9、-NID1-MC細(xì)胞中粘著斑激酶FAK磷酸化水平（磷酸化位點(diǎn)為397位酪氨酸）水平升高，表明FAK處于活化狀態(tài)，推測(cè)FAK可能是ERK/MAPK通路的上游調(diào)控蛋白。
　　綜上所述，本研究利用穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NID1蛋白和瞬時(shí)敲降NID1蛋白的細(xì)胞模型，首先發(fā)現(xiàn)NID1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并同時(shí)伴隨著EMT發(fā)生，從而證實(shí)了“NID1通過(guò)EMT促進(jìn)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移”這一學(xué)術(shù)猜想。然后，在穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NID1蛋白的細(xì)胞模型中，發(fā)現(xiàn)ERK/