微小RNA-1284在胃癌中作用及機(jī)制的研究.pdf

1、1.背景與目的:胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤，年患病率和死亡率均為世界平均水平的2倍以上。目前臨床上主要利用手術(shù)、化療和放療等綜合手段治療胃癌，但胃癌總體生存率并沒有明顯改善，特別是進(jìn)展期胃癌出現(xiàn)侵襲及轉(zhuǎn)移后不僅加重機(jī)體損害而且疾病預(yù)后惡化。目前，傳統(tǒng)的腫瘤藥物治療一般是指化學(xué)治療，具有不分?jǐn)澄?、毒性較大的特點，分子靶向治療比傳統(tǒng)的化療特異性強(qiáng)、毒副反應(yīng)小。以EFGR和ALK基因突變的非小細(xì)胞肺癌治療為例，過去傳統(tǒng)的化療有效率始終徘

2、徊在20％到30%左右，生存率在9～10個月，采用抑制此類基因突變的分子靶向藥物，治療有效率能翻一番，超過50%～60%，生存率可延長至18個月。因此，靶向治療可能成為未來腫瘤的個體化治療的關(guān)鍵，探尋細(xì)胞調(diào)控的關(guān)鍵分子靶點已成為當(dāng)前腫瘤治療研究的熱點。
　　微小RNA（miRNA）作為內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，其具有高效調(diào)控癌基因或抑癌基因的生物學(xué)特性，與腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和凋亡等密切相關(guān)，被認(rèn)為是高效靶向調(diào)控細(xì)胞途徑之一。最新

3、的胃癌miRNA表達(dá)譜芯片篩選研究報道了與胃癌相關(guān)的多個 miRNA，其中報道了miR-1284在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組織比原胃癌組織表達(dá)少，然而，對miR-1284在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能和作用機(jī)制并未見有深入研究和探討。為了驗證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究擬通過熒光定量 PCR方法檢測miR-1284在胃正常細(xì)胞株、胃癌細(xì)胞系、胃癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)情況，明確其在胃癌中的表達(dá)，并分析其與患者年齡、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理

4、分期等的相關(guān)性，明確其在胃癌臨床診斷和預(yù)后中的意義。同時構(gòu)建miR-1284慢病毒載體，觀察目的miR-1284在體內(nèi)外對胃癌腫瘤細(xì)胞的功能作用，利用基因芯片、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、實時定量PCR和Western Blot蛋白印跡實驗檢測靶基因。明確目的miR-1284與其靶基因在胃癌中的關(guān)系，闡明miR-1284在胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能和作用機(jī)制。
　　2.方法
　　2.1應(yīng)用Trizol試劑提取胃癌組織和細(xì)胞的總RNA，

5、應(yīng)用熒光定量 PCR方法檢測miR-1284在胃正常細(xì)胞株、胃癌細(xì)胞系、胃癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)情況，并分析其與患者年齡、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理分期等的相關(guān)性。
　　2.2構(gòu)建包含目的miR-1284的熒光慢病毒載體，陽性重組克隆進(jìn)行測序驗證，收集重組過表達(dá)目的miR-1284的病毒顆粒；Transwell法鑒定不同胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；采用目的miR-1284慢病毒顆粒和陰性對照病毒載體分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞M

6、GC-803和SGC-7901，嘌呤霉素篩選過表達(dá)miR-1284胃癌穩(wěn)定細(xì)胞株，熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞株miR-1284的表達(dá)；Transwell法和劃痕實驗檢測miR-1284對胃癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響；CCK-8法檢測miR-1284對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-1284對胃癌細(xì)胞周期和凋亡的影響；Hoechst染色法和AO-EB雙染色法檢測miR-1284對胃癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　2.3將轉(zhuǎn)染后穩(wěn)

7、定細(xì)胞株的細(xì)胞懸液200μl（6×106個/ml）每只，在裸鼠左側(cè)腋窩皮下注射構(gòu)建人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，隔2天1次，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體長徑(a)和短徑(b)，計算相對瘤體體積（RTV）并繪制腫瘤生長曲線，21天后脫頸椎法處死裸鼠，完整切取腫瘤組織并用HE和TUNEL染色確認(rèn)腫瘤組織和檢測組織細(xì)胞凋亡情況；將轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定細(xì)胞株的細(xì)胞懸液200μl（4×105個/ml）每只，注射入裸鼠尾靜脈構(gòu)建胃癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型，第36天后脫頸椎法處死裸

8、鼠，完整切取裸鼠肺部和肝臟組織，并用HE染色檢測胃癌肝肺轉(zhuǎn)移情況。
　　2.4采用全基因表達(dá)譜芯片檢測miR-1284過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞顯著差異表達(dá)的基因；生物信息學(xué)預(yù)測軟件預(yù)測目的miR-1284的靶基因，利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶基因；應(yīng)用實時定量PCR和Western Blot蛋白印跡實驗檢測靶基因EIF4A1及其下游基因c-Myc、MMP12、JUN、CDH1的mRNA及蛋白表達(dá)，應(yīng)用免疫組化法檢測胃癌標(biāo)本靶基

9、因EIF4A1蛋白表達(dá)。
　　3.結(jié)果
　　3.1 qRT-PCR結(jié)果顯示，74例胃癌患者中，26例胃癌患者的胃癌組織:miR-1284表達(dá)量高于癌旁正常組織，占35.14%；48例胃癌患者的胃癌組織miR-1284表達(dá)量低于癌旁正常組織，占64.86%，miR-1284在胃癌組織中的表達(dá)量明顯低于胃癌旁的正常組織，miR-1284在胃癌細(xì)胞株AGS、HGC-27、MGC-803和SGC-7901的表達(dá)量低于在胃上皮細(xì)胞株G

10、ES-1的表達(dá)量。miR-1284表達(dá)量與胃癌患者的年齡、性別、組織學(xué)分級、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)無統(tǒng)計學(xué)顯著意義，但miR-1284表達(dá)量與胃癌的腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)有統(tǒng)計學(xué)顯著意義。
　　3.2陽性重組克隆測序結(jié)果顯示miR-1284過表達(dá)載體重組序列無誤:Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，與胃癌細(xì)胞株AGS、HGC-27相比，胃癌細(xì)胞株MGC-803和SGC-7901的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)較多；熒光定量PCR檢測結(jié)果

11、顯示，miR-1284在胃癌細(xì)胞株MGC-803和SGC-7901中實驗組的表達(dá)量高于陰性對照組的表達(dá)量；Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-1284過表達(dá)的實驗組胃癌細(xì)胞株MGC-803和SGC-7901的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少；劃痕實驗結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞株SGC-7901在48小時時 miR-1284組細(xì)胞遷移間距為（312.42±16.87）μm較NC（陰性對照）組為（123.63±17.69）μm遷移細(xì)胞

12、間距大，胃癌細(xì)胞株MGC-803在48小時時 miR-1284組細(xì)胞遷移間距為（112.46±11.18）μm較NC（陰性對照）組為（28.74±8.62）μm遷移細(xì)胞間距大，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著意義；CCK-8實驗檢測結(jié)果顯示與陰性對照組相比，miR-1284過表達(dá)的實驗組胃癌細(xì)胞株MGC-803和SGC-7901的增殖能力降低；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-1284過表達(dá)的實驗組胃癌細(xì)胞株MGC-803和SGC-7

13、901的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞比例減少，miR-1284過表達(dá)的實驗組胃癌細(xì)胞株MGC-803和SGC-7901的細(xì)胞凋亡率增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著意義；Hoechst和AO-EB雙染檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-1284過表達(dá)的實驗組胃癌細(xì)胞株MGC-803和SGC-7901的細(xì)胞凋亡率增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著意義。
　　3.3裸鼠皮下移植瘤模型腫瘤體積測量的結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-1284過

14、表達(dá)的實驗組胃癌細(xì)胞株SGC-7901、MGC-803的裸鼠皮下移植瘤模型腫瘤體積較小，HE染色確認(rèn)皮下移植瘤組織為惡性胃癌組織，TUNEL檢測結(jié)果顯示miR-1284過表達(dá)的實驗組SGC-7901、MGC-803的裸鼠皮下移植瘤凋亡率增加；轉(zhuǎn)移瘤模型的肝肺組織病理檢查結(jié)果顯示，miR-1284過表達(dá)的實驗組的肺轉(zhuǎn)移率為10.00%，與陰性對照組的肺轉(zhuǎn)移率70.00%相比，miR-1284過表達(dá)的實驗組胃癌細(xì)胞株MGC-803的細(xì)胞肺轉(zhuǎn)

15、移率降低。
　　3.4全基因表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果顯示，按差異基因的篩選條件設(shè)定為log2∣Flod change∣≧1.5且P﹤0.05，共有143個基因為差異性表達(dá)，上調(diào)基因數(shù)97個，下調(diào)基因數(shù)46個；MiRanda、TargetScan、microRNA軟件預(yù)測miR-1284的靶基因交集為138個基因；芯片表達(dá)差異基因和生物信息學(xué)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因的交集為EIF4A1、KLF10、C8orf4和SUMO1基因；雙熒光素酶報告

16、實驗結(jié)果顯示：EIF4A13'UTR-NC+miRNA組和EIF4A13'UTR+ miRNA組的熒光素酶活性相比，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著意義；EIF4A13'UTR-NC+miRNA組和EIF4A13'UTR-MU+miRNA組的熒光素酶活性相比，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著意義；EIF4A13'UTR+ miRNA組和EIF4A13'UTR-MU+ miRNA組熒光素酶活性相比，EIF4A13'UTR-MU+miRNA組的熒光素酶活性明顯增加，差異有

17、統(tǒng)計學(xué)顯著意義；熒光定量PCR和Western blotting實驗結(jié)果顯示：與陰性對照組比較，上調(diào)胃癌細(xì)胞株MGC-803、SGC-7901的miR-1284表達(dá)后，實驗組靶基因EIF4A1和c-Myc、MMP12、JUN的mRNA和蛋白表達(dá)降低，CDH1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著意義；免疫組化結(jié)果顯示，人胃癌組織中EIF4A1的蛋白表達(dá)量較匹配的癌旁正常組織低，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著意義。
　　4.結(jié)論

18、　　4.1 miR-1284在胃癌細(xì)胞株的表達(dá)水平低于正常胃上皮細(xì)胞株GES-1，在胃癌組織中的表達(dá)量明顯低于胃癌組織，且miR-1284的表達(dá)量與胃癌的腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。
　　4.2成功構(gòu)建人miR-1284過表達(dá)慢病毒載體和miR-1284過表達(dá)的胃癌細(xì)胞株MGC-803、SGC-7901，miR-1284過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞MGC-803、SGC-7901的遷移、侵襲、增殖能力，促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC-803、SGC-7

19、901的凋亡，使MGC-803、SGC-7901的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期和S期細(xì)胞比例減少。
　　4.3 miR-1284過表達(dá)抑制裸鼠皮下移植瘤模型腫瘤的生長速度，促進(jìn)腫瘤組織的細(xì)胞凋亡，抑制裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。
　　4.4 miR-1284過表達(dá)對胃癌細(xì)胞基因譜表達(dá)有影響，EIF4A1是miR-1284的直接靶基因，miR-1284過表達(dá)可使胃癌細(xì)胞株MGC-803、SGC-7901的EIF4A1和c-

20、Myc、MMP12、JUN基因的mRNA和蛋白表達(dá)降低，CDH1的mRNA和蛋白表達(dá)增加。
　　4.5在胃癌患者中EIF4A1的蛋白表達(dá)與miR-1284表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，推測miR-1284過表達(dá)極有可能直接通過EIF4A1/CDH1/JUN/MMP12和EIF4A1/c-Myc信號通路抑制胃癌的進(jìn)展。
　　創(chuàng)新點：
　　1.體外雙熒光素酶報告實驗是研究microRNA和靶基因間相互作用的有效手段，本研究采用了此技術(shù)驗