HCN1通道基因敲除對(duì)小鼠膀胱Cajal間質(zhì)細(xì)胞中BK通道的表達(dá)和功能的影響.pdf

1、目的:
　　膀胱逼尿肌的興奮性異常是臨床上多種疾病如膀胱過(guò)度活動(dòng)癥(OveractiveBladder, OAB)、神經(jīng)源性膀胱等的共同發(fā)病機(jī)制之一。闡明膀胱興奮性調(diào)控的機(jī)制，對(duì)明確這些疾病的發(fā)病機(jī)制及臨床診療具有重要意義。目前關(guān)于膀胱興奮性調(diào)控的研究理論主要有神經(jīng)源性和肌源性兩大學(xué)說(shuō)。膀胱中類似于胃腸道的自身可以起搏并產(chǎn)生興奮的Caja1間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Caja1，ICCs）發(fā)現(xiàn)以來(lái)，肌源性

2、學(xué)說(shuō)日益得到重視和認(rèn)可。
　　研究發(fā)現(xiàn)膀胱ICCs上存在著多種離子通道和受體對(duì)其興奮性進(jìn)行調(diào)控，其中可引發(fā)起搏電流的超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道（Hyperpolarization-ActivatedCyclic Nucleotide-Gated Channels，HCN Channels）即HCN通道的發(fā)現(xiàn)，為ICCs作為興奮起搏細(xì)胞的理論提供了可能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。M受體（Muscarinic Receptors）、P2X3受體

3、（Purinergic P2X3 Receptors，P2X3 Receptors）等神經(jīng)受體可接受來(lái)自神經(jīng)的信號(hào)，參與ICCs興奮性的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽張也可調(diào)控ICCs的興奮性。此外，研究證實(shí)，在膀胱逼尿肌細(xì)胞之間、ICCs與逼尿肌細(xì)胞之間存在存在著細(xì)胞間通訊。以上研究說(shuō)明ICCs極有可能是膀胱自身源性的興奮性調(diào)控機(jī)制的樞紐，它整合并傳遞來(lái)自神經(jīng)、牽張刺激等調(diào)控信號(hào)，發(fā)起HCN通道起源的起搏電流信號(hào)，并通過(guò)多種離子通道、受體和細(xì)胞

4、間通訊將興奮傳遞至逼尿肌。這其中，HCN通道是核心，而與鈣離子相關(guān)的多種離子通道參與并扮演了重要角色。
　　HCN通道被普遍認(rèn)為是起搏電流發(fā)起通道，其不同亞型在心臟起搏和神經(jīng)節(jié)律調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，人類和大鼠膀胱ICCs上都存在HCN通道并記錄到其起搏電流If，且鼠類表達(dá)以HCN1通道為主。在大鼠逼尿肌過(guò)度活動(dòng)(DetrusorOveractivity, DO)時(shí)，HCN通道的表達(dá)及功能升高。在膀胱中，HCN通道很可能擔(dān)

5、任興奮起搏的角色，且與DO的形成有關(guān)。在與鈣離子相關(guān)的離子通道中，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道即BK通道（Large-Conductance Calcium-Activated Potassium Channels，BKChannels）本身對(duì)鈣離子沒(méi)有通透性，它引發(fā)的鉀外流可負(fù)反饋性地抑制鈣內(nèi)流。在平滑肌細(xì)胞中，BK通道的激活可限制去極化，抑制收縮，調(diào)節(jié)平滑肌使其舒張。研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)BK通道可影響膀胱興奮性，其上調(diào)或下調(diào)均可導(dǎo)致不同類型的膀胱功能

6、障礙。膀胱ICCs中也有BK通道的表達(dá)，在DO時(shí)，其表達(dá)及功能降低。BK通道參與了膀胱ICCs的興奮性調(diào)控，且與DO的形成有關(guān)。
　　HCN通道和BK通道存在著可能的順承關(guān)系，兩者都對(duì)ICCs興奮性的調(diào)節(jié)起著重要作用，干預(yù)HCN通道后BK通道的生理學(xué)改變是我們關(guān)注的內(nèi)容。HCN1通道是鼠類膀胱中主要的HCN通道亞型，本文旨在研究HCN1通道基因敲除對(duì)小鼠膀胱ICCs中BK通道的表達(dá)和功能的影響，并初步探討這種影響對(duì)膀胱興奮性調(diào)控的

7、意義。
　　方法：
　　1.本研究采用HCN1通道基因敲除(HCN1 knockout，HCN1 KO) C57BL/6J小鼠和HCN1通道野生型(HCN1 wide type，HCN1 WT) C57BL/6J小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別記為敲基因組和正常組。
　　2.表達(dá)檢測(cè):通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、熒光定量PCR(Q-PCR)實(shí)驗(yàn)在mRNA水平檢測(cè)敲基因小鼠膀胱中BK通道各亞基的表達(dá)變化;通過(guò)Western

8、blot(WB)實(shí)驗(yàn)在蛋白水平檢測(cè)敲基因小鼠膀胱中BK通道各亞基的表達(dá)變化;急性酶分離法分離培養(yǎng)膀胱原代ICCs，通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)敲基因小鼠膀胱ICCs中BK-α亞基的表達(dá)變化。
　　3.功能檢測(cè):通過(guò)離體逼尿肌肌條實(shí)驗(yàn)比較敲基因組和正常組小鼠肌條的收縮功能，然后檢測(cè)加入IBTX后小鼠肌條的收縮變化，比較敲基因組和正常組肌條收縮變化對(duì)IBTX的敏感程度以評(píng)價(jià)二者膀胱中BK通道的功能變化;急性酶分離法分離培養(yǎng)膀胱原代I

9、CCs，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡下ICCs內(nèi)鈣離子熒光采集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分別加入NS1619和IBTX后鈣熒光的變化，比較敲基因組和正常組ICCs內(nèi)鈣熒光對(duì)NS1619、IBTX的敏感程度以評(píng)價(jià)二者ICCs中BK通道的功能變化。
　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR、Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲基因組小鼠膀胱中BK通道的α、β1、β2、β3、β4亞基表達(dá)均顯著低于正常組(P＜0.01);
　　2.WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲基因組小鼠膀胱中BK通

10、道的α、β1、β2、β3、β4亞基表達(dá)均顯著低于正常組（α、β3、β4:P＜0.01;β1、β2: P＜0.05）;
　　3.急性酶分離法分離后培養(yǎng)，得到活性良好的膀胱原代ICCs;
　　4.免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲基因組小鼠膀胱ICCs中BK-α亞基表達(dá)顯著低于正常組(P＜0.01);
　　5.離體逼尿肌肌條實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未添加藥物條件下，敲基因組小鼠肌條收縮幅度和頻率均顯著低于正常組(P＜0.05，P＜0.01)

11、，加入IBTX后，敲基因組和正常組肌條收縮幅度均變大（P＜0.01，P＜0.05），頻率則沒(méi)有明顯變化(P＞0.05)，且敲基因組肌條收縮幅度的變化值顯著低于正常組(P＜0.05);
　　6.鈣熒光采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入NS1619后，敲基因組、正常組ICCs內(nèi)鈣熒光均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，加入IBTX后，敲基因組、正常組ICCs內(nèi)鈣熒光均顯著增高(P＜0.01)。且不論加入NS1619或IBTX，比較加藥前后I