miR-29b調(diào)控軟骨細(xì)胞肥大化的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　嚴(yán)重的創(chuàng)傷或某些疾病可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷，發(fā)生一系列病理變化，并造成關(guān)節(jié)軟骨不可逆的退行性改變，最終引發(fā)骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，60歲以上人群中約有50％患病，75歲以上人群中的OA發(fā)病率高達(dá)80％。目前全世界OA患者有3.6億人，國內(nèi)最新統(tǒng)計資料調(diào)查顯示，我國骨關(guān)節(jié)炎患者已達(dá)1.2億。據(jù)美國統(tǒng)計，每年應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎治療方面的花費(fèi)大約為5.46億美元，同時每年至少要

2、進(jìn)行50萬例的關(guān)節(jié)成形手術(shù)。OA的發(fā)病通常還伴有關(guān)節(jié)疼痛，對患者的正常生活產(chǎn)生重大影響。在病情嚴(yán)重時甚至可能導(dǎo)致肢體殘疾，大大降低患者的生活質(zhì)量，該病的最終致殘率為53％，故有“頭號致殘疾病”之稱。由于關(guān)節(jié)軟骨的解剖結(jié)構(gòu)較為特殊，其周圍沒有血管和神經(jīng)的支配，因此一旦發(fā)生損傷就難以進(jìn)行自我的修復(fù)。因此深入研究對軟骨損傷的修復(fù)機(jī)制具有重要的臨床價值和社會意義。
　　隨著近些年來組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展和不斷創(chuàng)新，組織工程軟骨逐漸成為一種

3、理想的軟骨損傷的新型修復(fù)方式。其中，組織工程軟骨的細(xì)胞來源及誘導(dǎo)方法等問題一直是軟骨組織修復(fù)領(lǐng)域研究的關(guān)鍵。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)被認(rèn)為是目前利用組織工程進(jìn)行軟骨構(gòu)建過程中的一類非常理想的種子細(xì)胞，其具有來源廣泛、低免疫原性，具有高度的多向分化潛能以及在體外進(jìn)行多代增殖和培養(yǎng)后仍能夠保持原有細(xì)胞形態(tài)和生理功能等諸多優(yōu)勢。但是，有研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的MSCs在成軟骨分化的后期，并不會分泌大量

4、的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)而形成關(guān)節(jié)軟骨，而是繼續(xù)分化為沒有修復(fù)作用的肥大化軟骨細(xì)胞，并最終形成無功能的纖維化軟骨或者鈣化。因此，如何抑制MSCs來源的軟骨細(xì)胞向肥大化軟骨細(xì)胞的分化，并使其保持軟骨細(xì)胞的相應(yīng)表型和特性，成為軟骨組織工程研究面臨的一個重要問題。
　　軟骨的形成過程以及軟骨組織生物學(xué)功能的發(fā)揮，這些過程都是通過骨形成蛋白及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和信號通路等多種因子綜合調(diào)控的結(jié)果，同時這些調(diào)控因子形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。近年來的研究表明，細(xì)胞

5、內(nèi)的微小RNA（microRNA，縮寫為miRNA）在軟骨細(xì)胞分化以及生物學(xué)功能發(fā)揮的過程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用。在眾多的miRNA中，miR-29b可以正向調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)的成骨分化。已有研究證實(shí)，組蛋白去乙?；?(histone deacetylase4，HDAC4)是miR-29b的下游靶基因之一。另外，HDAC4可以通過降低軟骨細(xì)胞肥大化的標(biāo)

6、志基因Runx2的表達(dá)，從而抑制軟骨細(xì)胞肥大化。由此，我們推測miR-29b很可能通過調(diào)節(jié)其下游的HDAC4來影響B(tài)MSCs成軟骨細(xì)胞分化的過程，使之向肥大化的軟骨細(xì)胞分化。本研究應(yīng)用miR-29b過表達(dá)和miR-29b抑制技術(shù)，針對這一可能調(diào)控過程及機(jī)制進(jìn)行了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　方法：
　　在課題組已建立的MSCs軟骨肥大化誘導(dǎo)體系的基礎(chǔ)上，本研究對miR-29b在MSCs成軟骨分化過程中的作用及其機(jī)制進(jìn)行探討。

7、　　一、采用已建立MSCs軟骨肥大化誘導(dǎo)體系培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)。番紅O固綠染色法檢測細(xì)胞團(tuán)的硫酸軟骨素的表達(dá)情況，確定體外成軟骨肥大化誘導(dǎo)成功與否。并分別取3、7、14、21、28d的細(xì)胞團(tuán)，采用RT-PCR檢測ColⅡ、ColⅩ、Runx2、Sox9、HDAC4和miR-29b的mRNA的表達(dá)情況。
　　二、在前一部分研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行miR-29b干預(yù)MSCs成軟骨肥大化的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組包括:①過表達(dá)組，轉(zhuǎn)染pre-miR-29b;②過

8、表達(dá)對照組，轉(zhuǎn)染Negative control;③抑制組，轉(zhuǎn)染antagomiR-29b;④抑制對照組，轉(zhuǎn)染antagomiR-29b control。所有實(shí)驗(yàn)組均于細(xì)胞誘導(dǎo)的第10d進(jìn)行首次轉(zhuǎn)染，然后每間隔2d進(jìn)行補(bǔ)充轉(zhuǎn)染。分別取誘導(dǎo)培養(yǎng)至第14d、21d和28d的軟骨細(xì)胞，用RT-PCR的方法檢測miR-29b在過表達(dá)和抑制表達(dá)的情況下對軟骨肥大化的相關(guān)基因ColⅡ、ColⅩ、Sox9、MMP13、Runx2等的mRNA表達(dá)的影響

9、。運(yùn)用番紅O固綠染色法檢測抑制組軟骨細(xì)胞中硫酸軟骨素分泌情況。利用免疫組化和Western blot方法，從蛋白水平證實(shí)miR-29b在軟骨肥大化的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　一、番紅O固綠染色法發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，肥大化組的軟骨細(xì)胞硫酸軟骨素分泌減少，尤其在誘導(dǎo)28d時差異顯著（P＜0.05），顯示體外誘導(dǎo)肥大化成功。軟骨標(biāo)志性基因ColⅡ mRNA的表達(dá):成軟骨階段呈上升趨勢，肥大化階段呈下降趨勢(P＜0.05);肥大化

10、相關(guān)基因ColⅩ mRNA表達(dá):成軟骨階段表達(dá)量較低，肥大化階段顯著升高(P＜0.05)。Runx2和miR-29b的表達(dá)量在成軟骨階段水平較低，在軟骨細(xì)胞肥大化的階段則顯著上升(P＜0.05);相反，Sox9的表達(dá)在成軟骨階段上升，而處于肥大化階段的細(xì)胞中表達(dá)下降(P＜0.05)。據(jù)此，我們認(rèn)為下調(diào)miR-29b的表達(dá)水平可延緩或阻斷MSCs來源的軟骨細(xì)胞的肥大化進(jìn)程。
　　二、利用miR-29b干預(yù)MSCs向成軟骨細(xì)胞肥大化的

11、方向分化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在miR-29b過表達(dá)組，軟骨分化的相關(guān)基因ColⅡ、HDAC4和Sox9的mRNA表達(dá)較對照組顯著降低(P＜0.05)，而軟骨肥大化的相關(guān)基因ColⅩ、MMP13和Runx2的mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05);在抑制miR-29b表達(dá)組中則相反，軟骨細(xì)胞肥大的相關(guān)基因表達(dá)較對照組顯著降低（P＜0.05），而軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)則會顯著升高(P＜0.05)。在番紅O固綠染色實(shí)驗(yàn)中，抑制miR-29b的細(xì)胞細(xì)

12、胞外基質(zhì)的分泌量較對照組顯著增多。在免疫組化實(shí)驗(yàn)中，抑制miR-29b的實(shí)驗(yàn)組X膠原的表達(dá)量較高。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示:miR-29b過表達(dá)組的ColⅡ、HDAC4和Sox9蛋白水平顯著升高（P＜0.05），ColⅩ、Runx2的mRNA表達(dá)顯著下降(P＜0.05);而抑制miR-29b表達(dá)組中各蛋白的表達(dá)情況則與過表達(dá)組相反。
　　結(jié)論：
　　miR-29b為軟骨細(xì)胞肥大化的正性調(diào)控因子，miR-29b