miR-29b通過靶向作用CCND2、Mcl-1對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、雖然近幾年miRNAs與肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的研究日益增多，但關(guān)于miR-29b與肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的研究很少。我們旨在研究miR-29b在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中對(duì)CCND2、Mcl-1蛋白的影響，分析miR-29b在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中是否有抑制增殖，促進(jìn)凋亡作用，從miR-29b角度探討肺動(dòng)脈高壓的分子機(jī)制對(duì)其病理過程的作用，為肺動(dòng)脈高壓的分子病理研究提供了新的理論基礎(chǔ)。
　　首先利用miRNA芯片技術(shù)，將野百合堿誘導(dǎo)及對(duì)照組大鼠的肺

2、動(dòng)脈組織進(jìn)行miRNA芯片分析，篩選出在肺動(dòng)脈高壓形成過程中有意義的miRNAs，進(jìn)一步用qRT-PCR驗(yàn)證野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓模型及低氧誘導(dǎo) PAH模型肺動(dòng)脈組織miR-29b相對(duì)表達(dá)量。為觀察 miR-29b對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，分別用miR-29b mimics、inhibitor或negative control對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行處理，利用CCK8試劑盒進(jìn)行處理后檢測(cè)OD值觀察細(xì)胞數(shù)量變化，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析細(xì)

3、胞周期，運(yùn)用AnnexinV-PI流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，并進(jìn)行各組間比較。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè) miR-29b的靶基因，利用蛋白免疫印記法檢測(cè)轉(zhuǎn)染 miR-29b mimics、inhibitor或 negative control后肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中CCND2、Mcl-1蛋白在各組間表達(dá)量的變化。最后比較野百合堿處理和 miR-29b mimic治療后右室收縮壓、右室肥厚指數(shù)和肺動(dòng)脈中膜比變化，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察miR-29b對(duì)肺動(dòng)脈高

4、壓的治療作用。
　　通過上述方法，我們觀察到，在基因芯片分析中，不同時(shí)間點(diǎn)肺動(dòng)脈組織中的miR-29b表達(dá)持續(xù)降低，且qRT-PCR驗(yàn)證，在PAH模型中miR-29b表達(dá)顯著降低；miR-29b通過抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，從而影響其數(shù)量；miR-29b可抑制CCND2、Mcl-1蛋白表達(dá)，沉默CCND2、Mcl-1后肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在體升高miR-29b可使右室收縮壓、右室肥厚指數(shù)和肺動(dòng)

5、脈中膜比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　因此在本研究中通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，我們證明：（1）在野百合堿和低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型中 miR-29b表達(dá)下調(diào)；（2）低氧處理肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，miR-29b的mRNA水平表達(dá)明顯降低，miR-29b可通過阻滯肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡影響其數(shù)量；（3）CCND2和Mcl-1是miR-29b介導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡的靶基因，miR-29b通過分別抑制CCND2和Mcl-1蛋白表達(dá)使肺動(dòng)脈平滑肌