豬過敏毒素C5a的DNA適配體篩選和評(píng)價(jià).pdf

1、過敏毒素C5a是補(bǔ)體系統(tǒng)級(jí)聯(lián)活化過程中產(chǎn)生的一個(gè)小片段蛋白，釋放到血液中，具有免疫調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，C5a也是重要的前炎癥性介質(zhì)，與炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。C5aR廣泛分布在髓樣細(xì)胞表面，C5a與細(xì)胞表面C5aR結(jié)合，釋放組織胺、血管活化因子、自由基及白細(xì)胞介素IL-6、IL-8等，導(dǎo)致平滑肌收縮、血管通透性增加。此外，高濃度的C5a是中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化劑,可誘導(dǎo)細(xì)胞順濃度梯度方向移動(dòng)。機(jī)體出現(xiàn)炎癥時(shí)，血液中的C

2、5a濃度增加，引起PMN在血管內(nèi)皮位置聚集，進(jìn)而穿過內(nèi)皮向組織浸潤，誘導(dǎo)產(chǎn)生并釋放大量的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致血管內(nèi)功能不全，使炎癥加重。研究證實(shí)過敏毒素C5a在機(jī)體許多疾病的病理過程中參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展，所以研究炎癥介質(zhì)C5a不僅對(duì)揭示炎癥反應(yīng)過程中的分子機(jī)制有重要的意義，而且對(duì)于尋求、開發(fā)有效的C5a拮抗劑控制其在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等病理過程中的作用，對(duì)于多種炎性疾病的治療和轉(zhuǎn)歸具有重大臨床價(jià)值，而研發(fā)豬C5a適配體拮抗劑作為新型養(yǎng)殖動(dòng)物

3、廣譜抗炎藥在獸醫(yī)領(lǐng)域同樣具有重大影響。
　　諸多研究者意識(shí)到用阻斷C5a與其受體（C5aR/CD88）結(jié)合的方法抑制炎癥反應(yīng)是極具臨床應(yīng)用前景的抗炎新途徑，然而抗體類抑制劑制備難度大、成本高、反復(fù)使用容易使機(jī)體出現(xiàn)過敏反應(yīng)等，探索與抗C5a抗體作用原理相似，而且更加便宜、安全、活性穩(wěn)定的拮抗劑成為抗炎新思路。適配體是一類能特異性地與各類生物靶標(biāo)以高親和力相結(jié)合的單鏈DNA或RNA，作用原理類似于抗體，通過兩者結(jié)合從而抑制受體靶標(biāo)的

4、生物活性，另外適配體易制備易修飾的獨(dú)特優(yōu)勢可彌補(bǔ)C5a抗體在臨床治療上的缺陷，適配體最大的優(yōu)點(diǎn)是沒有免疫原性，故在臨床用藥時(shí)能重復(fù)使用；隨著適配體在醫(yī)學(xué)，生命科學(xué)等領(lǐng)域的研究和在疾病的診斷與治療上的應(yīng)用，拮抗C5a活性適配體的篩選也成為了研究的熱點(diǎn)，因此，為了開發(fā)探索豬炎癥性疾病新型廣譜治療藥物，篩選豬C5a的核酸適配體是非常有必要的。
　　本論文采用毛細(xì)管電泳篩選策略，以豬C5a為靶標(biāo)進(jìn)行單鏈DNA適配體的篩選；并且對(duì)篩選得到的

5、適配體的親和力和拮抗活性進(jìn)行了考察。研究內(nèi)容主要包括：
　?。?）原核表達(dá)豬C5a蛋白。試驗(yàn)內(nèi)容：①將豬C5a蛋白基因分別克隆入pET32a和pET28a表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32 a-C5a和pET28a-C5a，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行一系列鑒定；②以SDS-PAGE及western blotting等方法鑒定重組質(zhì)粒是否成功表達(dá)豬C5a蛋白。③將鑒定正確的菌株大量

6、培養(yǎng)，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。④利用銅柱親和層析技術(shù)純化含有組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白。⑤利用豬中性粒細(xì)胞趨化及誘導(dǎo)試驗(yàn)鑒定目的蛋白的生物活性。
　　（2）豬C5a的單鏈DNA適配體篩選和評(píng)價(jià)。①將具有生物活性的重組豬C5a蛋白作為靶標(biāo)，選用基于CE的高效分離能力的CE-SELEX技術(shù)，將未結(jié)合序列與結(jié)合復(fù)合物分離，經(jīng)過六輪篩選，最終獲得能與該蛋白具有較高結(jié)合力的DNA適配體序列組。②以高通量測序和生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行候選適配體的結(jié)構(gòu)解析；

7、③通過EMSA和SPR技術(shù)測定適配體與C5a蛋白結(jié)合的親和力和特異性；④最后利用體外細(xì)胞趨化試驗(yàn)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測適配體S1拮抗豬C5a生物活性的能力。
　　通過上述兩大部分試驗(yàn)，獲得了以下結(jié)果：
　?。?）成功構(gòu)建了pET32a-C5a和pET28a-C5a兩株重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21后優(yōu)化其誘導(dǎo)條件，成功獲得了大量表達(dá)豬C5a蛋白的菌株，通過銅柱親和層析純化蛋白，SDS-PAGE和western-blottin

8、g檢測分析表明，重組豬C5a蛋白獲得表達(dá)，重組蛋白大小為10,000，純化后豬C5a蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定，其一級(jí)結(jié)構(gòu)正確，純度達(dá)到90％以上，濃度為2.5g/L。體外細(xì)胞試驗(yàn)檢測到C5a具有趨化和誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活性，為下一步大量純化豬C5a蛋白用于適配體篩選奠定了基礎(chǔ)。
　?。?）豬C5a單鏈DNA適配體的篩選結(jié)果顯示，經(jīng)過六輪篩選，從毛細(xì)管電泳峰圖上可以看出靶標(biāo)蛋白與核酸復(fù)合物峰圖，候選序列高通量測序獲得55000多條序列，序列統(tǒng)計(jì)

9、比對(duì)分析后挑選出的六條代表序列與C5a親和力測定，適配體S1顯示出高親和力和結(jié)合特異性，KD值為4.81μM。通過體外中性粒細(xì)胞趨化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)適配體S1和S2均可以抑制豬C5a的趨化活性，流式細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果得出適配體S1能夠抑制C5a與豬中性粒細(xì)胞表面C5aR的結(jié)合，從而抑制其活性作用。
　　通過以上結(jié)果，得出如下4條結(jié)論：
　?。?）成功構(gòu)建了pET32a-C5a和pET28 a-C5a兩株豬C5a蛋白基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，純

10、化獲得的豬C5a蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定，其一級(jí)結(jié)構(gòu)正確，體外細(xì)胞試驗(yàn)證明其具有生物活性，為下一步適配體篩選奠定了基礎(chǔ)。
　?。?）建立了篩選豬C5a核酸適配體的高效篩選條件；CE-SELEX技術(shù)結(jié)合高通量測序和SPR技術(shù)，針對(duì)豬C5a蛋白快速高效的篩選到特異性結(jié)合的適配體。
　　（3）初步建立適配體高通量測序大數(shù)據(jù)的分析流程，不僅提高了篩選效率，而且避免了傳統(tǒng)LTS單點(diǎn)測序，可能錯(cuò)失更優(yōu)適配體的缺點(diǎn)。本試驗(yàn)通過序列分析軟件，將大數(shù)據(jù)

11、統(tǒng)計(jì)分類，更有目標(biāo)性的挑選候選適配體。
　?。?）體外細(xì)胞趨化試驗(yàn)中，適配體S1和S2均可有效抑制C5a誘導(dǎo)的豬中性粒細(xì)胞的趨化，拮抗能力相比，S1比S2強(qiáng)，更有治療豬C5a介導(dǎo)的炎性疾病的潛力。
　　論文創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.首次通過原核表達(dá)獲得有活性的豬C5a蛋白，在獸醫(yī)領(lǐng)域?yàn)樯钊胙芯緾5a致炎機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為其拮抗劑的研發(fā)提供條件。
　　2.建立了毛細(xì)管篩選技術(shù)，用于豬C5a適配體的高效篩選，并獲得了能夠體