ETEC K88細胞適配體的篩選和快速檢測研究.pdf

1、大腸桿菌(E.coli)引起的腹瀉在世界范圍內(nèi)成為了一個主要的公共衛(wèi)生問題。其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88(EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC K88)是一種最常見的引起腹瀉的致病菌。它易于通過食物攝取進入體內(nèi)，極易使新生兒和斷奶仔豬的胃腸道發(fā)生感染。因此，建立一種新的快速靈敏檢測ETEC K88的方法是非常必要的。
　　適配體(Aptamer)是ssDNA或者RNA，可以與靶標進行高親和力和高特

2、異性的結(jié)合。目前適配體常用的篩選手段為指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)。其靶標包括金屬離子、有機小分子、藥物、甚至單分子蛋白質(zhì)和細胞。與傳統(tǒng)的抗體相比，它具有廉價、易合成和可修飾的優(yōu)點，被廣泛的應(yīng)用于分子檢測、診斷治療和生物標記物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域。
　　石墨烯具有獨特的平面結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的導(dǎo)電、導(dǎo)熱性。氧化石墨烯(GO)是一種富氧基團(C/O≈2)的石墨烯，與石墨烯相比它極大的增強了親和性及水溶性。同時，作為一種高效的熒光淬滅劑，

3、它能夠淬滅熒光體（上轉(zhuǎn)換納米材料、量子點及染料分子）的熒光，能穩(wěn)定的吸附ssDNA。近年來，利用GO優(yōu)良的特性，相繼開發(fā)了各種納米生物傳感器。
　　本論文以ETEC K88為目標細菌，通過SELEX方法篩選出細胞適配體，并測定適配體與靶標之間的親和力和特異性;構(gòu)建了以細胞適配體為特異性探針，以GO為熒光淬滅劑的納米生物傳感器用于ETEC K88的快速檢測。具體實驗結(jié)果如下:
　　一、采用CELL-SELEX技術(shù)，通過11輪正

4、篩選和4輪反篩選，獲得了一組富集度高、特異性強的適配體序列。經(jīng)純化和克隆，得到37個陽性克隆子。測序后進行一級同源性比對和二級結(jié)構(gòu)分析，可將它們分成三個家族。其中適配體A04的親和力最高(Kd=28 nmol)。后續(xù)實驗表明，ETEC K88與適配體A04的結(jié)合具有高特異性和靈敏性。
　　二、利用GO納米熒光淬滅劑的特性以及Klenow fragment(KF)-輔助靶標循環(huán)放大的功能，構(gòu)建了一種新型的納米傳感器用于ETECK88

5、的快速檢測。該傳感器包括捕獲探針和信號探針。靶標加入前兩個探針形成了部分雙鏈結(jié)構(gòu)(PDSJ)并且吸附在石墨烯上，此時熒光淬滅。當加入靶標后，靶標與PDSJ形成了復(fù)合物，從而使PDSJ從GO上釋放出來，熒光得以恢復(fù)。隨后KF的加入引發(fā)了PDSJ的聚合反應(yīng)，從而置換出靶標，置換出來的靶標能夠與其它的PDSJ結(jié)合，進入下一輪循環(huán)。靶標的循環(huán)利用使更多的PDSJ得以釋放，檢測的熒光信號顯著加強。實驗結(jié)果表明，在菌體濃度102～108CFU·mL