蓖麻毒素寡核苷酸適配子篩選方法的比較研究.pdf

1、蓖麻毒素蛋白來源于蓖麻籽中，由A、B兩條肽鏈通過二硫鍵連接而成。其中，A鏈為效應(yīng)鏈，具有糖苷酶活性，能使核糖體失活；B鏈為結(jié)合鏈，含有兩個半乳糖結(jié)合位點。其毒性作用機理主要是抑制蛋白質(zhì)合成。 指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化(SELEX)，也稱之為體外篩選。通過這項技術(shù)能夠從龐大的核酸文庫中篩選獲得與靶分子具有高親和力、高特異性結(jié)合的寡核苷酸適配子。由于寡核苷酸適配子結(jié)合的靶物質(zhì)范圍廣，包括小分子、多肽、蛋白和細胞等，而且與靶分子結(jié)合的親

2、和力高、特異性強，所以SELEX技術(shù)在基礎(chǔ)研究、藥物篩選以及臨床診斷等方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景。本研究的目的是借助SELEX技術(shù)從隨機ssDNA文庫中篩選獲得特異識別蓖麻毒素蛋白的寡核苷酸適配子，為開展對蓖麻毒素生物傳感器研究和阻斷劑研究奠定了基礎(chǔ)。全文分為兩部分： 一、構(gòu)建了含40個隨機序列全長87nt的隨機ssDNA文庫，采用微孔法和親和樹脂層析法兩種傳統(tǒng)的SELEX篩選方法對蓖麻毒素進行篩選。隨機挑選的22條適配子的一級序

3、列可分為6個家族，模擬的二級結(jié)構(gòu)中存在莖環(huán)、凸環(huán)結(jié)構(gòu)，這可能是與靶蛋白作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。親和力測定結(jié)果顯示，適配子A3的親和力最高，Kd值為105nM。 二、將高效毛細管電泳技術(shù)作為分離手段引入到對蓖麻毒素蛋白的SELEX篩選中，建立了全新的高效、快速的CE-SELEX篩選平臺。硝酸纖維膜結(jié)合實驗結(jié)果表明，僅經(jīng)CE-SELEX兩輪篩選后富集文庫與蓖麻毒素靶蛋白的結(jié)合率就上升至60.2％，而四輪篩選之后高達87.2％。隨機挑選的11

4、條寡核苷酸適配子根據(jù)序列同源性分析的結(jié)果分為3個家族，其中兩條序列C1、C5與蓖麻毒素的親和力較高，Kd值分別是80nM和58nM。此外，還發(fā)現(xiàn)通過CE-SELEX得到的適配子C1、C5與傳統(tǒng)方法得到的A3序列具有非常高的同源性。隨后的適配子酶聯(lián)實驗和點雜交實驗進一步證明這3條寡核苷酸適配子不僅與靶蛋白的親和力高，而且其具有高的特異選擇性。這些特異識別蓖麻毒素蛋白的寡核苷酸適配子可以被用作生物傳感器的識別元件，為今后實現(xiàn)蓖麻毒素的生物傳