agr系統(tǒng)影響金葡菌T7SS組分表達(dá)的初步研究及T7噬菌體cDNA展示文庫構(gòu)建.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）簡(jiǎn)稱金葡菌，是引起醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的重要致病菌，能夠引起皮膚及軟組織感染，也可引起全身性感染。近年來，隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等耐藥菌株的出現(xiàn)，金葡菌感染呈現(xiàn)發(fā)病率高、耐藥性強(qiáng)、治療困難、致死率高的態(tài)勢(shì)。金葡菌感染過程中，毒力因子的分泌是其毒力發(fā)揮的重要環(huán)節(jié)。Ⅶ型分泌系統(tǒng)(typeⅦsecretion system，T7S system，T7SS)

2、是存在于金葡菌中重要的蛋白質(zhì)分泌途徑，參與金葡菌毒力因子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，與金葡菌的毒力作用密切相關(guān)，深入研究金葡菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)及其分泌機(jī)制對(duì)于有效防控金葡菌感染具有重要意義。
　?、餍头置谙到y(tǒng)是在研究結(jié)核分枝桿菌減毒疫苗株的過程中發(fā)現(xiàn)的。Sherman等發(fā)現(xiàn)RD1區(qū)域的丟失是結(jié)核分枝桿菌減毒株毒力減弱的遺傳學(xué)原因，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RD1區(qū)域編碼蛋白構(gòu)成了一個(gè)蛋白分泌系統(tǒng)，繼Ⅰ-Ⅵ型分泌系統(tǒng)之后，將其命名為Ⅶ型分泌系統(tǒng)。因Ⅶ型分泌系統(tǒng)與結(jié)

3、核分枝桿菌和金葡菌等重要的致病菌毒力密切相關(guān)而受到越來越廣泛的關(guān)注。長(zhǎng)期以來對(duì)Ⅶ型分泌系統(tǒng)的研究主要集中于結(jié)核分枝桿菌。在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)了esx-1～esx-5五個(gè)同源編碼基因簇。繼結(jié)核分枝桿菌之后，Pallen等人在金葡菌等多種革蘭陽性菌中都發(fā)現(xiàn)了類似的同源結(jié)構(gòu)。金葡菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)基因簇包含多個(gè)基因，編碼的蛋白包括金葡菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)分子、膜蛋白及其他分泌相關(guān)組分。
　　金葡菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)的功能發(fā)揮受到多種因素的嚴(yán)格調(diào)控。

4、研究表明，金葡菌附屬基因調(diào)節(jié)子(accessory gene regulator，agr)影響Ⅶ型分泌系統(tǒng)的分泌因子EsxA的轉(zhuǎn)錄，在金葡菌中與esxA位于同一基因簇上的其他Ⅶ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因編碼蛋白與EsxA關(guān)系密切，agr對(duì)這些基因的作用尚不清楚，探討agr系統(tǒng)對(duì)金葡菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)的調(diào)控作用有助于增進(jìn)對(duì)金葡菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。
　　探尋Ⅶ型分泌系統(tǒng)分泌機(jī)制，對(duì)其組分之間的相互作用研究必不可少。噬菌體展示文庫技術(shù)是研究蛋白質(zhì)

5、之間相互作用、核酸與蛋白質(zhì)相互作用的重要工具，為研究Ⅶ型分泌系統(tǒng)膜蛋白之間的相互作用，我們構(gòu)建了金葡菌噬菌體展示文庫。文庫的構(gòu)建還可用于金葡菌的其他研究工作。
　　本論文研究?jī)?nèi)容分為兩部分，第一部分采用蛋白質(zhì)的原核表達(dá)方法體外表達(dá)金葡菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)組分EssB、EssA、EsaB的重組蛋白，繼而免疫小鼠獲得相應(yīng)的抗體。隨后，采用RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)金葡菌agr缺失對(duì)Ⅶ型分泌系統(tǒng)相關(guān)組分轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的影響

6、。第二部分采用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)N315菌株的cDNA文庫。本研究主要獲得了以下結(jié)果:
　　1、agr功能缺失對(duì)金葡菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)影響的初步研究
　　1)Ⅶ型分泌系統(tǒng)膜復(fù)合物蛋白EssB、EssA、EsaB抗體的制備:①分析Ⅶ型分泌系統(tǒng)膜基因結(jié)構(gòu)，采用PCR的方法克隆相關(guān)組分蛋白質(zhì)EssB、EssA、

7、EsaB的編碼基因。②通過酶切連接的方法將編碼基因片段分別克隆入表達(dá)質(zhì)粒pET-22B(+)、pET-30a(+)獲得重組表達(dá)質(zhì)粒，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21獲得重組蛋白表達(dá)菌。③IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)重組蛋白，優(yōu)化表達(dá)條件，獲得的工程菌表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鑒定均以包涵體的形式表達(dá)。④表達(dá)得到的重組蛋白包涵體經(jīng)Ni-柱親和層析純化后，SDS-PAGE鑒定。⑤純化后的蛋白溶液經(jīng)透析復(fù)性，BCA法蛋白定量后，凍存?zhèn)溆?。⑥用純化后的蛋白溶液免疫B

8、ALB/c小鼠，制備重組蛋白抗體，ELISA法評(píng)價(jià)抗體的效價(jià)，加等體積甘油凍存?zhèn)溆谩?br>　　2)agr功能缺失對(duì)金葡菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)影響的初步研究:以金葡菌臨床分離株XQ野生株及傳代獲得的agr功能缺失株XQM株為研究對(duì)象。
　　①熒光定量PCR檢測(cè)野生株和agr缺失株Ⅶ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)組分蛋白EsaA和分泌蛋白EsxA、EsxB、EsaC的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示agr功能缺失株中Ⅶ型分泌系統(tǒng)編碼基因esaA、esaC、esxA、es

9、xB的轉(zhuǎn)錄水平均低于XQ野生株。②Western blot檢測(cè)Ⅶ型分泌系統(tǒng)膜復(fù)合物蛋白EssA、EsaA和分泌蛋白EsxB、EsaC的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，agr功能缺失株中膜蛋白EssA和分泌蛋白EsxB的表達(dá)水平明顯低于XQ野生株，而EsaA及分泌蛋白EsaC的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差別。
　　2、N315菌株T7噬菌體cDNA展示文庫的構(gòu)建。
　　1)cDNA文庫的構(gòu)建:①采用Tripure法提取金葡菌N315的總RNA，總R

10、NA用DNaseⅠ消化去除基因組DNA污染，之后分離純化mRNA，mRNA反轉(zhuǎn)錄制備cDNA兩條鏈并苯酚/氯仿/異戊醇抽提后，乙醇沉淀。②在cDNA末端定向添加EcoRⅠ/HindⅢ接頭，并雙酶切處理獲得粘端cDNA片段。③處理好的cDNA連接T7Select10-3載體后體外包裝T7噬菌體，構(gòu)建成原始cDNA文庫，原始重組克隆鋪板擴(kuò)增獲得噬菌體擴(kuò)增文庫。
　　2)cDNA文庫的初步評(píng)價(jià):①雙層平板實(shí)驗(yàn)測(cè)定文庫庫容。結(jié)果顯示原始文

11、庫的重組克隆數(shù)為1.335×106 pfu，擴(kuò)增文庫的噬菌體滴度為3.26×1010 pfu/ml。②PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定文庫質(zhì)量，文庫陽性插入率達(dá)到100％;插入片段大小均勻分布在300-2000 bp之間，可用于后續(xù)的篩選實(shí)驗(yàn)。
　　綜上所述，我們通過對(duì)野生株和agr功能缺失株的比較，初步明確了agr功能缺失導(dǎo)致金葡菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)膜蛋白EssA和分泌蛋白EsxB的表達(dá)水平明顯降低。這是繼agr敲除導(dǎo)致Ⅶ型分泌系統(tǒng)分泌蛋白Esx