用T7噬菌體展示肽庫(kù)篩選肺癌早期檢測(cè)分子標(biāo)志群.pdf

1、安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文用T7噬菌體展示肽庫(kù)篩選肺癌早期檢測(cè)分子標(biāo)志群姓名：陳貽玲申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：鄧松華;曹廣文20090601安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 漿 4℃孵育過(guò)夜富集抗體。 SDS-PAGE 電泳驗(yàn)證富集到的抗體后將 20 管肺癌組的抗體及 20 管對(duì)照組的抗體各自合并成一管。 （4）肺癌特異性相關(guān)肽的富集 ）肺癌特異性相關(guān)肽的富集 為了富集可以和肺癌自身

2、抗體特異結(jié)合的展示肽， 我們對(duì)肺癌 T7 噬菌體展示肽庫(kù)進(jìn)行了正反向的 5 輪親和篩選。取噬菌體擴(kuò)增液 30μl 用 10%BSA 1:40 稀釋，先與20μl 的對(duì)照組抗體 4℃孵育 2 小時(shí)，未結(jié)合的上清再與 20μl 肺癌組抗體混合 4℃孵育過(guò)夜，保留結(jié)合到瓊脂糖珠上的噬菌體再擴(kuò)增，此為一輪篩選，如此反復(fù)五輪。每輪篩選后均測(cè)定重組率和滴度。 （5）肺癌特異標(biāo)志物的篩選 ）肺癌特異標(biāo)志物的篩選 為了找到確實(shí)可在臨床上實(shí)際應(yīng)用的肺

3、癌特異標(biāo)志物， 隨機(jī)挑取五輪篩選后的 3000 個(gè)噬菌體克隆用 ELISA 方法進(jìn)一步兩輪篩選。 在酶標(biāo)儀 450nm 波長(zhǎng)下讀取 OD 值。 按下列公式計(jì)算并判斷結(jié)果：用空白孔調(diào)零后，樣品 OD 值／陰性對(duì)照平均 OD 值，比值≥2．0，判斷為陽(yáng)性；樣品 OD 值／陰性對(duì)照平均 OD 值，比值<2．0，判斷為陰性。陰性對(duì)照 OD 值低于 0.05 作 0.05 計(jì)算，高于 0.05 按實(shí)際 OD 值計(jì)算。肺癌組為陽(yáng)性、 非肺癌為

4、陰性的噬菌體即為有意義的、 具有診斷肺癌潛能的樣本。 （6）測(cè)序和蛋白功能預(yù)測(cè)）測(cè)序和蛋白功能預(yù)測(cè) ELISA 篩選出的噬菌體克隆，測(cè)序后經(jīng)過(guò) NCBI 上的BLAST 序列比對(duì)找到完全一致或者最接近的已知基因序列，推測(cè)我們獲得的基因的是否與癌癥相關(guān)。 【結(jié)果】 【結(jié)果】 （1）構(gòu)建成原始文庫(kù)的庫(kù)容量為 5.4×106 pfu/ml，重組率為 60%. 擴(kuò)增庫(kù)的滴度為 9.6×108pfu/ml。（2）五輪親和篩選

5、后噬菌體肽庫(kù)的重組率和滴度均有了很大的提高， 反映出具有某些特征的噬菌體得到了富集。 （3） 重復(fù)兩輪 ELISA共篩選出 13 個(gè)有意義的噬菌體。其測(cè)序結(jié)果獲得后，其中 1 個(gè)為未知其功能的新基因（817 號(hào)和 1525 號(hào)為同一未知功能的新基因） ，其余的均有報(bào)道與癌癥相關(guān)，且這 13 個(gè)基因中包含三組相同的基因。 【結(jié)論】 結(jié)論】 （1）T7 噬菌體構(gòu)建的 cDNA 文庫(kù)可以很好的展示各種小豐度蛋白。 （2）經(jīng)過(guò)五輪親和篩選表達(dá)肺