噬菌體隨機環(huán)7肽庫篩選胰島素受體高親和肽作為肝細胞癌靶向載體.pdf

1、背景：腫瘤細胞高表達分子被作為腫瘤靶向治療的藥物靶點。腫瘤靶向治療有三種研究策略。第一種策略是獲得腫瘤藥物靶點的單克隆抗體。第二種策略是噬菌體肽庫篩選獲得與藥物靶點分子高親和力結合的小分子肽。第三種策略是獲得生長因子片段及其衍生物，以阻斷生長因子受體的功能。 胰島素受體是一種生長因子受體，在肝癌細胞表面表達高于正常肝細胞，是肝癌靶向治療的侯選靶點分子之一。噬菌體肽庫是在一種噬菌體外殼蛋白末端連接上大量結構各異的肽鏈。當肽庫與胰島

2、素受體結合，只有與受體具有高親和力的多肽被篩選出來。通過提取噬菌體DNA測序獲得多肽的氨基酸殘基序列。再用多肽合成儀人工合成多肽。這種多肽可能具有肝癌等腫瘤靶向性。用噬菌體肽庫篩選腫瘤高表達分子的高親和力多肽是研究腫瘤靶向藥物的一條重要途徑。 目的：噬菌體隨機環(huán)7肽庫篩選能與胰島素受體高親和力結合的多肽，人工合成多肽作為放射性核素或腫瘤化療藥物載體，用于肝癌的放射性核素顯像診斷和肝癌的靶向治療。 方法：篩選：將大鼠肝胰島

3、素受體包被在培養(yǎng)皿上，用噬菌體環(huán)7肽庫與胰島素受體結合，收集結合在固相受體上的噬菌體。擴增篩選獲得的噬菌體后用于下一輪篩選。通過數(shù)輪篩選，獲得與受體親和力高的噬菌體。測序：與受體親和力高的噬菌體在LB培養(yǎng)皿上感染大腸桿菌ER2738，以藍白斑實驗挑取攜帶噬菌體的大腸桿菌克隆。擴增12個噬菌體單克隆，并用ELISA定性法測定噬菌體與胰島素受體的親和力。提取了11個胰島素受體結合實驗陽性、且OD值較高的噬菌體克隆DNA測序，獲知連接在噬菌體

4、外殼pⅢ蛋白末端的環(huán)7肽氨基酸殘基序列。多肽親和力鑒定：固相法多肽合成儀合成環(huán)7肽，并暫時定名為CY-10。125I標記CY-10用于與胰島素受體的體外結合分析。體外結合實驗包括飽和分析、Scachard分析、競爭抑制實驗等。 CY-10親腫瘤特性：比較CY-10結合肝癌細胞和正常肝細胞的差異。研究125I-CY-10在肝癌SMMC7721細胞荷瘤裸鼠體內(nèi)分布。131I標記CY-10作肝癌SMMC7721細胞荷瘤裸鼠全身顯像，了

5、解131I-CY-10在肝癌組織的分布。 根據(jù)CY-10在荷瘤鼠的體內(nèi)分布和顯像表現(xiàn)，評價CY-10作為肝細胞癌靶向診斷和治療的可能性。 結果：●通過三輪親和篩選，每輪篩選噬菌體的回收處于同一水平。挑取第三輪篩選獲得的噬菌體克隆12個進行擴增，ELISA定性分析12個噬菌體與胰島素受體的結合能力，結果表明12個克隆全部為陽性反應。挑取11個OD值較高的陽性噬菌體克隆提取DNA測序，結果顯示12個噬菌體克隆的插入序列完全相

6、同。插入序列的結構是：ATGACGCCAATGCTTCGACTG。翻譯成多肽的序列是QSKHWRH。 ●根據(jù)測序結果，設計并人工合成環(huán)10肽C-QSKHWRH-C-Y，暫時命名為CY-10。125I-CY-10與胰島素受體結合的離解常數(shù)Kd值為8.901×10-8mol/L。與豬胰島素比較，CY-10與胰島素受體的親和力更高，IC50CY/IC50Ins=1.716。 ●CY-10和SMMC7721細胞株的結合能力高于和

7、正常肝細胞株L-02的結合能力。荷瘤裸鼠體內(nèi)分布實驗顯示，腫瘤攝取高峰出現(xiàn)在注射后3小時，3小時腫瘤/肌肉的％ID/g比值為2.2218。其他組織器官攝取高峰出現(xiàn)在1小時。CY-10注射后15小時，大多數(shù)內(nèi)臟器官CY-10分布明顯下降，腫瘤組織下降幅度小，適合動物全身顯像。24小時13I-CY-10荷肝癌鼠全身顯像示腫瘤組織攝取高于對側正常組織。 結論：1.研究獲得了一種與胰島素受體有高親和力的多肽； 2.胰島素受體高親