隨機噬菌體12肽庫篩選宮頸癌患者血清腫瘤標志物的初步研究.pdf

1、背景：宮頸癌在發(fā)展中國家上升為第2位女性常見的惡性腫瘤，僅次于乳腺癌。據世界衛(wèi)生組織估計，在宮頸癌每年新發(fā)病例數中，中國約占世界總發(fā)病數的28％。已嚴重威脅中國女性健康，造成社會的重大負擔。但宮頸癌早期發(fā)現后及時治療效果顯著、預后良好。有文獻報道早期宮頸癌的5年生存率可達92％，因此宮頸癌的早發(fā)現、早期診斷和治療是非常重要的。目前宮頸癌的診斷方法包括傳統(tǒng)的宮頸涂片細胞學檢查、陰道鏡檢查和組織學檢查。一定程度上提高了宮頸癌在早期的診斷，但

2、這些方法依然仍有各自的缺陷，如巴氏涂片檢查靈敏度低，陰道鏡檢查難以檢查到細小的病灶，組織活檢的依從性差等。近年血清腫瘤標志物如糖鏈抗原199(CA199)、鱗狀上皮細胞癌抗原(SCC-Ag)、血清糖類抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)已作為宮頸癌的輔助檢測項目，但其總的靈敏度和特異度并不高。所以尋找一種針對早期宮頸癌其靈敏度和特異度都高的血清腫瘤標志物非常重要。Smith發(fā)明的噬菌體展示技術(PDT)對尋找腫瘤血清標志物提供了

3、條件，本研究利用PDT，以早期宮頸癌患者血清為靶分子，可能篩選出與宮頸癌患者血清特異性結合的短肽。
　　目的：用隨機噬菌體12肽庫對宮頸癌患者血清進行三輪差異性淘選，找出能與宮頸癌患者血清特異性結合的陽性噬茵體株，通過擴大樣本和與不同種類的腫瘤患者血清進行再鑒定，挑出與早期宮頸癌患者血清特異結合且親和力最高的噬菌體株，將其提取單鏈DNA后進行測序得到相應短肽，為宮頸癌的早期診斷提供新的腫瘤標志物，為進一步尋找宮頸癌相關腫瘤標志物奠

4、定了基礎。
　　方法：1.采取6例正常人血清及6例早期宮頸癌患者新鮮血清分別混合包被在96孔酶標板中（兩孔正常人血清，一孔宮頸癌患者血清），進行三輪差異性篩選，每輪都先將噬菌體肽庫與前兩孔正常人血清結合，再將剩余未結合噬菌體移至第三孔與早期宮頸癌患者血清結合，結合后用洗脫液洗脫第三孔與早期宮頸癌患者血清結合的噬菌體，并對其進行擴增，通過三輪的篩選與擴增，與早期宮頸癌患者血清親和力高的噬菌體得到富集，得到特異性結合的陽性噬菌體。2.

5、用最后一輪篩選所得的噬菌體劃板培養(yǎng)。在每塊板上選取多個相對距離較遠的單克隆噬菌體株，對其擴增，然后用篩選時的6例正常人血清及6例早期宮頸癌患者血清用ELISA法檢測所選取的各單克隆噬菌體株與早期宮頸癌患者血清的親和力，選取出顏色穩(wěn)定且差別明顯的幾株陽性噬菌體。3.再擴大樣本含量檢測所篩選出的噬菌體對早期宮頸癌患者血清的親和力，挑選出與早期宮頸癌患者血清結合親和力最好的噬菌體株。4.對挑選出的陽性噬菌體株提取其單鏈DNA進行測序，再根據遺

6、傳密碼表得到相應的短肽。
　　結果：通過三輪篩選，與宮頸癌患者血清結合的噬菌體富集率逐輪提高，提高近100倍。挑取單個噬菌體株后經反復ELISA驗證后得到特異性較好的7號噬菌體株。7號噬菌體克隆行ELISA檢測6例正常人血清及6例宮頸癌患者血清，結果顯示正常人組OD值為0.056±0.010，宮頸癌組為0.151±0.040，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義;7號噬菌體克隆行ELISA檢測50例正常人血清及50例宮頸癌患者血清，結果

7、顯示正常人組OD值為0.070±0.023，宮頸癌組為0.157±0.040，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義;ELISA驗證7號噬菌體克隆分別與8例宮頸癌患者血清、8例CIN患者血清、8例卵巢癌患者血清及8例正常人血清行ELISA檢測，結果顯示宮頸癌患者組OD值為0.174±0.018，卵巢癌組為0.052±0.007，CIN組為0.076±0.010，正常人組為0.052±0.006，宮頸癌組與其他組差異有統(tǒng)計學意義。分析7號噬菌體R

8、OC曲線下面積為0.956，P＜0.0001，有統(tǒng)計學意義，ROC曲線下面積95％的可信區(qū)間為[0.896，0.987]; Medcalc軟件分析其特異度為94％及敏感性為84％;7號噬菌體測序結果為:5'-ATG CAC CGG ACG CGT CAGCGA ACC ATT CGT AGC CGA-3'，氨基酸序歹為:SATNGSLTRPVH。7號噬菌體克隆的DNA序列與鼠類、人類行同源核酸比對，未見其同源序列;將7號噬菌體克隆的氨基