T7噬菌體展示人源抗體庫(kù)篩選百草枯抗體.pdf

1、百草枯(1，1’-二甲基_4，4’-二氯二吡啶，PQ)是一種在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用廣泛的非選擇性除草劑，它的大量使用給世界農(nóng)業(yè)帶來(lái)貢獻(xiàn)，同時(shí)它的高致死率也引起了全球的關(guān)注。全世界每年都有多起百草枯中毒事件的報(bào)道，隨著報(bào)道的增多，醫(yī)生和學(xué)者們也開(kāi)始對(duì)它關(guān)注起來(lái)。百草枯中毒的致死率為90%以上，導(dǎo)致中毒的原因有很多，如皮膚接觸，意外吸入或吞食以及自主吞服，其中自殺性吞服百草枯是主要原因。由于百草枯毒性劇烈，并發(fā)癥較多且往往伴隨有不可逆的后遺癥，而且臨

2、床上目前尚無(wú)特效解毒藥，因此具有特異性以及高親和力的百草枯抗體的研究很有必要。人源非免疫抗體由于不會(huì)產(chǎn)生或只會(huì)有很小的免疫反應(yīng)而受到關(guān)注。
　　 噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)由于無(wú)需免疫動(dòng)物，可直接從噬菌體抗體庫(kù)中淘選出特異噬菌體抗體，可以得到按常規(guī)免疫方法難以獲得的人源抗體，且所展示的抗體與其所對(duì)應(yīng)的基因存在于同一個(gè)重組噬菌體內(nèi)，獲得抗體的同時(shí)也就獲得了它的基因，便于用抗體工程大規(guī)模生產(chǎn)抗體。因此可作人源抗體庫(kù)的理想載體。
　　

3、 本研究的目的是制備特異性中和百草枯的單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)部分主要包括全套人源抗體基因的克隆，抗體庫(kù)的構(gòu)建、動(dòng)物免疫、抗體庫(kù)的篩選、單克隆抗體的表達(dá)、純化。
　　 研究?jī)?nèi)容主要有以下幾個(gè)方面：
　　 將噬菌體的外殼蛋白10A在BLT5615中表達(dá)出來(lái)，純化后免疫家兔獲得用于T7噬菌體展示篩選的抗噬菌體外殼蛋白抗體，為T7噬菌體展示人源抗體庫(kù)篩查抗百草枯抗體奠定基礎(chǔ)。
　　 從健康志愿者外周血中分離淋巴細(xì)胞，用Tri

4、zol法提取總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)mRNA成cDNA后分別克隆人全套抗體重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)基因，并利用重疊延伸PCR技術(shù)重組連接成抗體庫(kù)構(gòu)建所需要的VH-linker-VL單鏈抗體基因。經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶切后與T7噬菌體載體相連，完成體外包裝后，侵染宿主BLT5403擴(kuò)增得到初級(jí)庫(kù)。
　　 采用固相篩選與液相篩選交替進(jìn)行的方式從人源抗體庫(kù)中篩選抗百草枯抗體。固相篩選：用OVA/BSA偶聯(lián)的

5、百草枯作為抗原包被在固相支持物上，加入抗體庫(kù)孵育一定時(shí)間，洗去未結(jié)合的噬菌體從而富集特異噬菌體。液相篩選：羧基化的百草枯小分子與氨基化的磁珠偶聯(lián)，加入抗體庫(kù)孵育一定時(shí)間，洗去未結(jié)合的噬菌體從而篩選特異性結(jié)合的噬菌體。
　　 第一輪和第三輪用磁珠篩選，第二輪和第四輪分別用BSA偶聯(lián)的百草及枯OVA偶聯(lián)的百草枯包被固相載體篩選。經(jīng)過(guò)4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”篩選過(guò)程，獲得抗原特異性較強(qiáng)的百草枯scFv噬菌體抗體。擴(kuò)增特異性較強(qiáng)的噬菌體

6、抗體株中的目的片段，構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)并純化抗體，對(duì)可溶性抗體的結(jié)合和競(jìng)爭(zhēng)活性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 本實(shí)驗(yàn)制備了T7噬菌體衣殼蛋白多克隆抗體，為噬菌體展示篩選特異性抗體實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。成功構(gòu)建了庫(kù)容較大，多樣性好的T7Select單鏈抗體庫(kù)，為篩選抗多種單鏈抗體奠定了基礎(chǔ)。利用百草枯為抗原，直接從非免疫人源噬菌體抗體庫(kù)中篩選噬菌體抗體克隆，表達(dá)之后得到1株具有較好抑制率的特異性抗體，由于非免疫人源噬菌體抗體庫(kù)的庫(kù)容非常大，而噬菌體