核糖體展示Anticalin模擬抗體庫的構(gòu)建及其在雌二醇、百草枯模擬抗體篩選中的應(yīng)用.pdf

1、本論文介紹了核糖體展示（ribosome display）方法用于小分子環(huán)境化學(xué)污染物模擬抗體(anticalin)篩選的原理、實驗技術(shù)，并以典型環(huán)境化學(xué)污染物雌二醇、百草枯為研究對象，對它們的模擬抗體進行了活性鑒定。
　　雌二醇是一種小分子甾體類激素,在組織液及血液中的含量可反應(yīng)婦產(chǎn)科、內(nèi)科、內(nèi)分泌科、骨科及腫瘤等多種疾病,具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。因其可以提高畜禽瘦肉比并促進動物生長，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用。但由于雌二醇可在

2、動物組織內(nèi)形成殘留，通過食物鏈危害人類健康，使男性兒童乳腺發(fā)育呈女性化，男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常或引起病變，女性兒童提前發(fā)育，并導(dǎo)致女性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生率上升。因此，對肉及其肉制品中雌二醇的監(jiān)測是確保廣大市民食用“放心肉”的必要措施。
　　百草枯（Paraquat,PQ）又名克蕪蹤，是一種速效觸殺型滅生性季銨鹽類除草劑，是我國廣泛使用的除草劑之一。百草枯有效成分為1，1′-二甲基-4，4′-聯(lián)吡啶陽離子鹽,它在農(nóng)作物中的殘

3、留對人、獸有毒害作用。百草枯可以經(jīng)胃腸道、呼吸道和皮膚吸收，以導(dǎo)致肺纖維化。我國國標(biāo)GB1633321996規(guī)定:菜籽油、柑桔、成品糧、梨和蘋果中PQ最大允許殘留量分別為0.05、0.2、0.5、0.05和0.05mg/kg。
　　利用核糖體展示抗體庫庫容量大、建庫和篩選方法簡便的優(yōu)勢，構(gòu)建Anticalin模擬抗體庫。以脂質(zhì)運載蛋白Lipocalin家族之一：膽汁三烯結(jié)合蛋白（bilin-binding protein BBP）

4、基因為模板，設(shè)計包含16個隨機突變位點的引物合成Anticalin模擬抗體庫。同時引入核糖體展示必需的全部組件，采用引物重疊PCR技術(shù)將Anticalin庫與組件進行拼接，從而構(gòu)建了核糖體展示的Anticalin模擬抗體庫。將構(gòu)建的文庫進行體外轉(zhuǎn)錄和體外翻譯后，以小分子雌二醇、百草枯為靶標(biāo)，利用固相和液相親和方法篩選抗雌二醇、百草枯抗體。通過改變Mg2+濃度將篩選到的模擬抗體-核糖體-mRNA三聯(lián)復(fù)合體解離，獲得模擬抗體所對應(yīng)的mRNA