運(yùn)用核糖體展示技術(shù)篩選SEB抗體的初步研究.pdf

1、目的： 建立核糖體展示庫(kù)，利用建立的核糖體展示技術(shù)進(jìn)行篩選SEB抗體的研究。 方法： 本試驗(yàn)第一部分為構(gòu)建原核表達(dá)SEB蛋白的重組質(zhì)粒。選用了已成為在大腸桿菌中蛋白表達(dá)的首選的Invitrogen的pET系統(tǒng)，通過(guò)SEB基因片段與N端具有6個(gè)組氨酸PET32a載體相連接，使表達(dá)產(chǎn)物N端融合6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，采用金屬離子螯合的親和層析法，利用HiTrapChelatingNi柱純化目標(biāo)蛋白。提供了核糖體展示篩選所需抗

2、原。 本試驗(yàn)第二部分為構(gòu)建源于小鼠單鏈可變區(qū)基因的核糖體展示庫(kù)，并利用核糖體展示技術(shù)進(jìn)行篩選SEB抗體的初步研究。通過(guò)TRIzol法提取了Balb/c和C57小鼠的總RNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增小鼠的重鏈可變區(qū)(VH)以及輕鏈可變區(qū)(VL)，擴(kuò)增和連接了核糖體展示所需要的所有元件，構(gòu)建了包括T7啟動(dòng)子、莖環(huán)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、單鏈抗體基因庫(kù)、間隔序列的核糖體展示的基因摸板。其后對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄和體外翻譯，以重組SEB為抗原進(jìn)行

3、了初步篩選。 結(jié)果： 成功構(gòu)建了能夠表達(dá)出SEB蛋白的重組質(zhì)粒，命名為SEB321。以3mmol/LIPTG誘導(dǎo)，30℃振搖4h，可表達(dá)出SEB蛋白，進(jìn)一步利用HiTrapChelatingNi柱進(jìn)行了親和純化，再以進(jìn)行了Westernblot鑒定。成功構(gòu)建了源于小鼠單鏈可變區(qū)基因的核糖體展示庫(kù)，并且測(cè)定出最終庫(kù)容量為7.33×1013。其后對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄和體外翻譯，表明其可以有效地進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄翻譯。利用核糖體展

4、示技術(shù)以重組SEB蛋白為抗原進(jìn)行了初步篩選，獲得陽(yáng)性結(jié)果。 結(jié)論： 建立了庫(kù)容量為7.33×1013的源自非免疫小鼠脾臟的單鏈抗體可變區(qū)基因片段的核糖體展示庫(kù)。摸索了建庫(kù)條件，并且利用商業(yè)載體PET32a為原核表達(dá)載體成功表達(dá)出重組SEB蛋白，以重組SEB蛋白為抗原，進(jìn)行了初步篩選，篩選SEB抗體結(jié)果為陽(yáng)性。證明了源自非免疫小鼠脾臟的單鏈抗體可變區(qū)基因片段的核糖體展示庫(kù)能夠快速有效篩選抗體，為本課題組以后利用核糖體展示進(jìn)