核糖體工程技術(shù)在刺糖多孢菌上的初步應(yīng)用.pdf

1、多殺菌素,又名多殺霉素(Spinosad),是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)進(jìn)行有氧發(fā)酵產(chǎn)生的產(chǎn)于細(xì)胞內(nèi)的次級代謝產(chǎn)物,具有較高的殺蟲活性、對非靶標(biāo)動物不起作用和殺蟲作用機(jī)理不同尋常等生物學(xué)特性,在防治田間蟲害和儲糧蟲害上具有廣闊的市場前景和良好的應(yīng)用價值。本文根據(jù)核糖體工程理論,利用藥物抗性突變技術(shù)篩選多殺菌素高產(chǎn)菌株,這是核糖體工程技術(shù)首次在糖多孢菌屬中的應(yīng)用,不僅為今后核糖體技術(shù)在其他種屬微生物

2、的應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ),也為多殺菌素高產(chǎn)菌株的選育開辟了一條新的、有效的途徑。本文通過核糖體工程技術(shù)誘變選育多殺菌素突變株,主要結(jié)論如下:
　　 1、最小抑菌濃度的測定。在試驗中發(fā)現(xiàn)刺糖多孢菌在含鏈霉菌40Mg/mL時生長受到抑制,所以其最小抑制濃度為40μg/mL。
　　 2、建立了連續(xù)抗性篩選培養(yǎng)法,并通過高效液相色譜分析法發(fā)現(xiàn)其中一株鏈霉素抗性突變株的發(fā)酵產(chǎn)物中存在兩個與多殺菌素組分A和D不一樣的組分。
　　

3、 3、新物質(zhì)的分離提純。通過大孔樹脂吸附,硅膠層析和制備色譜等一系列方法對其中一種新物質(zhì)進(jìn)行分離提純,得到其中一個組分含量在99.6％的白色粉末。
　　 4、新物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定。通過紅外、NMR、質(zhì)譜對新物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,確定新物質(zhì)的分子式為C33H50O9,分子量為590.74,在結(jié)構(gòu)上與多殺菌素系列物相比在四核環(huán)部分上缺少了福樂胺糖(forosamine)的組分,可能與己知的多殺菌素系列物在殺蟲活性、生物合成機(jī)制和代謝調(diào)控途徑

4、存在差異。
　　 5、對剌糖多孢菌的抗性突變株進(jìn)行DNA序列分析,發(fā)現(xiàn)了在第128位的A突變?yōu)镚,由賴氨酸(AAG)突變?yōu)榫彼?AGG),第341位的G突變?yōu)锳,由精氨酸(CGC)突變?yōu)榻M氨酸(CAC),這些突變點位于rpsL基因(編碼核糖體S12蛋白)的鏈霉素敏感域。已知rpsL基因通過增加翻譯因子來提高蛋白質(zhì)的翻譯活性,進(jìn)而活化次級代謝調(diào)控。rpsL基因上的點突變與刺糖多孢菌鏈霉素抗性突變株產(chǎn)生的兩種新物質(zhì)是否有直接聯(lián)系有