擬南芥葉綠體核糖體PSRP-3超表達的功能研究.pdf

1、核糖體是合成蛋白質(zhì)的細胞器，其功能是按照mRNA的指令高效且精確地合成多肽鏈。到目前為止，單個核糖體蛋白的功能大多數(shù)情況下是未知的。完整的葉綠體核糖體包含59個蛋白，6個是葉綠體特有的，它們是由核基因編碼，然后轉(zhuǎn)運到葉綠體。研究擬南芥中這些由核基因編碼的特有蛋白以及它們的作用機制有助于我們進一步認識高等植物核糖體的功能以及其分子調(diào)控機理。在本研究中，我們采用Sense和Antisense技術(shù)手段構(gòu)建了PSRP-3的超表達和反義抑制載體并

2、轉(zhuǎn)化Co10型擬南芥，進而對超表達的轉(zhuǎn)基因植株從生理生化以及分子水平進行了詳細的研究。主要的結(jié)果如下： PSRP-3(plastid-specific ribosomal protein3)蛋白是葉綠體核糖體上的特有蛋白之一，該基因的超表達明顯提高了擬南芥生長速度，據(jù)此我們選取四株具有生長梯度的Psrp-3超表達轉(zhuǎn)基因苗，分別命名為L1、L3、L4和L5。其葉面積分別是野生型的1.37、1.5、1.46、1.16倍；鮮重是1.

3、1、1.27、1.29、1.18倍，干重是1.12、1.34、1.32、1.21倍。RT-PCR實驗結(jié)果表明在四個Psrp-3基因超表達植株中，該基因的轉(zhuǎn)錄水平是和生長狀況成一定程度的正相關(guān)。為了從蛋白水平觀察PSRP-3在轉(zhuǎn)基因苗和野生型的表達情況，我們制取了PSRP-3多克隆抗體并進行免疫印跡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSRP-3的蛋白表達和轉(zhuǎn)錄本情況相似，也是和轉(zhuǎn)基因苗的生長狀況成一定程度的正相關(guān)。表明轉(zhuǎn)基因植物生物量的增加確實是由于PSRP-3

4、超表達造成。 為了進一步研究造成生物量增加的原因，我們首先測定了轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素熒光動力學，結(jié)果表明PSII最大光化學量子產(chǎn)量Fv/Fm基本沒有變化，說明光系統(tǒng)沒有受到影響，和我們測定的色素含量變化結(jié)果是一致的；轉(zhuǎn)基因植株的光化學淬滅系數(shù)qP高于野生型，說明轉(zhuǎn)基因材料的電子傳遞活性比野生型強；而轉(zhuǎn)基因植株的NPQ與PSRP-3表達成負相關(guān)，也就是PSRP-3表達量越高，非光化學淬滅系數(shù)NPQ越低， L1、L3、L4和L5分別是

5、野生型的34.5、19.1、13.4、18.8％，表明吸收的能量用于熱耗散的部分越小，相對整體而言，用于光合作用合成的部分就增加了，這就必然會提高生物量，這也與前述結(jié)果一致。然后我們測定了光合速率、蒸騰速率和氣孔導度，結(jié)果同樣顯示與基因表達成正相關(guān)，L1、L3、L4和L5的光合速率分別是野生型的2.45、3.31、3.22、1.54倍，呼吸速率分別是1.44、1.65、2.0、1.30倍，氣孔導度分別是1.65、2.38、2.35、1.

6、57倍。 轉(zhuǎn)基因植株比野生型生物量明顯增加，光合測定結(jié)果是和PSRP-3成正相關(guān)，推測可能與葉綠體的發(fā)育有關(guān)，帶著這個問題我們觀察了葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的葉綠體發(fā)育都很完好，類囊體垛疊在一起形成的基粒類囊體和沒有垛疊的基質(zhì)類囊體相互連接，均勻分布；但是轉(zhuǎn)基因植株中基粒類囊體的片層數(shù)明顯高于野生型對照，并且排列整齊、致密，野生型中的基粒類囊體的片層數(shù)為9±2.5，而轉(zhuǎn)基因植株中為17±2.0。

7、為了更深入的研究PSRP-3超表達對類囊體膜蛋白穩(wěn)態(tài)水平影響，我們用蛋白免疫印跡的方法研究了轉(zhuǎn)基因植株中類囊體膜蛋白的相對含量，結(jié)果顯示PSII的核心蛋白CP43和CP47，PSI的反應中心蛋白PsaA/B，核基因編碼的放氧復合物亞基PsbO，細胞色素Cyt f，ATP合成酶復合物亞基CF1β和IMCII與野生型相比基本沒變化。藍綠溫和膠電泳結(jié)果顯示對類囊體膜蛋白復合物的影響也沒有明顯變化，缺失CP43的PSII條帶含量比野生型略為少些

8、，則暗示了光系統(tǒng)II復合物更加穩(wěn)定。 我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對葡萄糖比較敏感。在野生型擬南芥中，只有當糖濃度高于7％才會表現(xiàn)出糖響應的特征：色素合成和蓮座發(fā)育受到抑制；但是轉(zhuǎn)基因植株不到4％就表現(xiàn)出了類似的特征。外源ABA實驗暗示轉(zhuǎn)基因植株對糖的敏感是由于對ABA超敏感造成的。 因此，PSRP-3超表達可以增加基粒類囊體的片層數(shù)，使用于接受光的相對面積增大，提高光合速率，降低非光化學淬滅系數(shù)NPQ，單位時間內(nèi)用于合成