擬南芥葉綠體核糖體PSRP-3超表達(dá)的功能研究.pdf

1、核糖體是合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器，其功能是按照mRNA的指令高效且精確地合成多肽鏈。到目前為止，單個(gè)核糖體蛋白的功能大多數(shù)情況下是未知的。完整的葉綠體核糖體包含59個(gè)蛋白，6個(gè)是葉綠體特有的，它們是由核基因編碼，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體。研究擬南芥中這些由核基因編碼的特有蛋白以及它們的作用機(jī)制有助于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)高等植物核糖體的功能以及其分子調(diào)控機(jī)理。在本研究中，我們采用Sense和Antisense技術(shù)手段構(gòu)建了PSRP-3的超表達(dá)和反義抑制載體并

2、轉(zhuǎn)化Co10型擬南芥，進(jìn)而對超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株從生理生化以及分子水平進(jìn)行了詳細(xì)的研究。主要的結(jié)果如下： PSRP-3(plastid-specific ribosomal protein3)蛋白是葉綠體核糖體上的特有蛋白之一，該基因的超表達(dá)明顯提高了擬南芥生長速度，據(jù)此我們選取四株具有生長梯度的Psrp-3超表達(dá)轉(zhuǎn)基因苗，分別命名為L1、L3、L4和L5。其葉面積分別是野生型的1.37、1.5、1.46、1.16倍；鮮重是1.

3、1、1.27、1.29、1.18倍，干重是1.12、1.34、1.32、1.21倍。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在四個(gè)Psrp-3基因超表達(dá)植株中，該基因的轉(zhuǎn)錄水平是和生長狀況成一定程度的正相關(guān)。為了從蛋白水平觀察PSRP-3在轉(zhuǎn)基因苗和野生型的表達(dá)情況，我們制取了PSRP-3多克隆抗體并進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSRP-3的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄本情況相似，也是和轉(zhuǎn)基因苗的生長狀況成一定程度的正相關(guān)。表明轉(zhuǎn)基因植物生物量的增加確實(shí)是由于PSRP-3

4、超表達(dá)造成。 為了進(jìn)一步研究造成生物量增加的原因，我們首先測定了轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)，結(jié)果表明PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm基本沒有變化，說明光系統(tǒng)沒有受到影響，和我們測定的色素含量變化結(jié)果是一致的；轉(zhuǎn)基因植株的光化學(xué)淬滅系數(shù)qP高于野生型，說明轉(zhuǎn)基因材料的電子傳遞活性比野生型強(qiáng)；而轉(zhuǎn)基因植株的NPQ與PSRP-3表達(dá)成負(fù)相關(guān)，也就是PSRP-3表達(dá)量越高，非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ越低， L1、L3、L4和L5分別是

5、野生型的34.5、19.1、13.4、18.8％，表明吸收的能量用于熱耗散的部分越小，相對整體而言，用于光合作用合成的部分就增加了，這就必然會(huì)提高生物量，這也與前述結(jié)果一致。然后我們測定了光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度，結(jié)果同樣顯示與基因表達(dá)成正相關(guān)，L1、L3、L4和L5的光合速率分別是野生型的2.45、3.31、3.22、1.54倍，呼吸速率分別是1.44、1.65、2.0、1.30倍，氣孔導(dǎo)度分別是1.65、2.38、2.35、1.

6、57倍。 轉(zhuǎn)基因植株比野生型生物量明顯增加，光合測定結(jié)果是和PSRP-3成正相關(guān)，推測可能與葉綠體的發(fā)育有關(guān)，帶著這個(gè)問題我們觀察了葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的葉綠體發(fā)育都很完好，類囊體垛疊在一起形成的基粒類囊體和沒有垛疊的基質(zhì)類囊體相互連接，均勻分布；但是轉(zhuǎn)基因植株中基粒類囊體的片層數(shù)明顯高于野生型對照，并且排列整齊、致密，野生型中的基粒類囊體的片層數(shù)為9±2.5，而轉(zhuǎn)基因植株中為17±2.0。

7、為了更深入的研究PSRP-3超表達(dá)對類囊體膜蛋白穩(wěn)態(tài)水平影響，我們用蛋白免疫印跡的方法研究了轉(zhuǎn)基因植株中類囊體膜蛋白的相對含量，結(jié)果顯示PSII的核心蛋白CP43和CP47，PSI的反應(yīng)中心蛋白PsaA/B，核基因編碼的放氧復(fù)合物亞基PsbO，細(xì)胞色素Cyt f，ATP合成酶復(fù)合物亞基CF1β和IMCII與野生型相比基本沒變化。藍(lán)綠溫和膠電泳結(jié)果顯示對類囊體膜蛋白復(fù)合物的影響也沒有明顯變化，缺失CP43的PSII條帶含量比野生型略為少些

8、，則暗示了光系統(tǒng)II復(fù)合物更加穩(wěn)定。 我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對葡萄糖比較敏感。在野生型擬南芥中，只有當(dāng)糖濃度高于7％才會(huì)表現(xiàn)出糖響應(yīng)的特征：色素合成和蓮座發(fā)育受到抑制；但是轉(zhuǎn)基因植株不到4％就表現(xiàn)出了類似的特征。外源ABA實(shí)驗(yàn)暗示轉(zhuǎn)基因植株對糖的敏感是由于對ABA超敏感造成的。 因此，PSRP-3超表達(dá)可以增加基粒類囊體的片層數(shù)，使用于接受光的相對面積增大，提高光合速率，降低非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ，單位時(shí)間內(nèi)用于合成