人工進化丙型肝炎病毒（HCV）C和E1區(qū)噬菌體展示文庫的構(gòu)建及初步篩選.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝臟疾病的主要原因之一，并與肝硬化和肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。全世界約有1.7億HCV感染者，HCV的感染越來越引起人們的重視。HCV基因序列的高度變異性，主要表現(xiàn)為病毒各種基因型、亞型及準種變異的存在和免疫逃避現(xiàn)象，使病毒得以逃避宿主免疫系統(tǒng)的作用而造成病毒的持續(xù)感染，因而難以治療及預(yù)防。HCV沒有理想的細胞模型，除黑猩猩外也沒有方便的動物模型，這使HCV致病機制及疫苗的研究遇到了極大的困難。DNA改組技術(shù)，

2、通過基因在分子水平上的重組，改變基因原有核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并定向篩選具有預(yù)期性狀的突變體，賦予表達產(chǎn)物以新的功能。它是一項全新的體外人工進化模式，是迄今為止所知道的最有效的分子進化技術(shù)。噬菌體展示技術(shù)(PDT)是利用絲狀噬菌體外殼蛋白來展示外源多肽的新技術(shù)。它使隨機肽庫和編碼他們的DNA序列聯(lián)系起來，通過和特異性的靶分子(抗體、酶、細胞表面受體等)進行結(jié)合，可以快速地從肽庫中篩選出所需的目的基因。HCV的編碼基因呈高度變異性，機體

3、感染HCV后易發(fā)生免疫耐受，因此，采用傳統(tǒng)方法難以獲得對不同HCV株型同時具有防治功效的疫苗。要克服這種免疫耐受現(xiàn)象，就必須避開高變區(qū)，選擇相對保守區(qū)進行實驗，同時誘導機體產(chǎn)生對預(yù)防和清除不同株型HCV感染具有重要作用的體液及細胞免疫應(yīng)答。核心區(qū)(C區(qū))序列具有高度遺傳保守性，C基因表達產(chǎn)物具有良好的抗原穩(wěn)定性。在自然感染病程中，核心蛋白已顯示出能誘導產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫。E1蛋白可能對于病毒的脫殼、進入細胞、與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合等病毒-細

4、胞的相互作用中起著重要作用。因此，C和E1具有的多種功能促使人們從不同角度對其進行研究，以期探討HCV的致病機制，為預(yù)防和治療HCV感染提供新的策略。 本研究主要進行了如下工作： 1.丙型肝炎病毒C和E1區(qū)的DNA改組利用DNA改組技術(shù)進行不同基因型的HCVC和E1區(qū)的人工進化。首先，以1a和1b基因型HCV質(zhì)粒載體為模板，利用PCR擴增了兩段具有較高序列同源性的1kb左右的基因片段，兩者相比較同源性大于83％。然后將其

5、等量混合后，在Mg2+存在的條件下，用DNaseⅠ切割成50bp左右的小片段。這些小片段在不外加引物的條件下，利用PCR反應(yīng)進行重聚，再將重聚物經(jīng)過一輪正常的PCR擴增。結(jié)果獲得了與原來片段大小相當?shù)幕蚱?。DNA改組技術(shù)為進一步篩選高活性的丙型肝炎病毒C和E1區(qū)基因打下基礎(chǔ)，有利于從一組序列同源性程度較高的基因庫構(gòu)建隨機嵌合基因，并為改組其他基因家族提供了借鑒。 2.人工進化丙型肝炎病毒C和E1區(qū)噬菌體展示文庫的構(gòu)建將通過D

6、NA改組技術(shù)進行人工進化獲得的HCVC和E1區(qū)基因，克隆于噬菌體載體pCANTAB5S，電轉(zhuǎn)化抑制型大腸桿菌E.coliTG1，構(gòu)建人工進化HCVC和E1區(qū)噬菌體展示文庫，庫容為1.64×106。噬菌體的庫容和多樣性能夠滿足篩選的要求。以輔助噬菌體M13KO7援救后，得到噬菌體滴度為1.86×1011cfu/ml的次級噬菌體庫。這為下一步文庫的初步篩選奠定了基礎(chǔ)。 3.人工進化丙型肝炎病毒C和E1區(qū)噬菌體展示文庫的初步篩選以C和

7、E1區(qū)單克隆抗體對噬菌體展示文庫進行4輪淘篩，在抗體包被量逐輪減少的情況下，產(chǎn)率逐漸升高，說明能與單克隆抗體特異性結(jié)合的陽性噬菌體克隆得到了特異性富集。然后，隨機選取篩選后的20個噬菌體克隆，用高滴度HCV陽性血清通過雙抗體夾心ELISA進行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，以正常人血清作為對照。結(jié)果表明12個克隆具有較好的特異結(jié)合活性，而與正常人血清無特異反應(yīng)，表現(xiàn)出較好的親和力。 結(jié)論： 1.成功進行了丙型肝炎病毒C和E1區(qū)的人工進