二甲雙胍聯(lián)合辛伐他汀協(xié)同抑制MDA-MB-231細(xì)胞NF-κB通路及生長(zhǎng)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)分別研究二甲雙胍(Metformin，Met)、辛伐他汀(Simvastatin，Sim)及兩者聯(lián)合在體外對(duì)三陰性高侵襲性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中NF-κB活性的影響，分別檢測(cè)單藥及聯(lián)合用藥干預(yù)后MDA-MB-231細(xì)胞的活性及增值的變化，并進(jìn)一步探討可能發(fā)生的作用機(jī)制。客觀評(píng)價(jià)二甲雙胍、辛伐他汀及兩者聯(lián)合是否能夠成為T(mén)NBC個(gè)體化及綜合性治療的輔助用藥，針對(duì)NF-κ B信號(hào)通路的靶向治療能否使乳腺癌的綜合性治療更加

2、完善，最終為預(yù)防、治療及預(yù)后提高TNBC的臨床治療有效率提供新的治療觀點(diǎn)。
　　方法:在體外培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，應(yīng)用不同濃度的Met(0、0.1、0.5、2.5、12、5mmol/l)、不同濃度的Sim(0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0μ mol/l)及兩藥聯(lián)合進(jìn)行干預(yù)24h、48h，用MTT比色法觀察其對(duì)該細(xì)胞增殖的影響，并進(jìn)一步探討單藥及兩藥聯(lián)合分別抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增

3、殖與NF-κ B活性受抑制之間的依賴(lài)關(guān)系。檢測(cè)對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-231細(xì)胞活性、細(xì)胞周期的變化。蛋白印跡法(Westernblot)分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組NF-κB、CCND1的變化，為進(jìn)一步探討MDA-MB-231細(xì)胞NF-κB的激活受抑制提供科學(xué)依據(jù)。
　　結(jié)果和結(jié)論:
　　1.二甲雙胍對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生物活性的影響
　　MTT分析結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的二甲雙胍作用與MDA-MB-231細(xì)胞24h后，

4、與溶劑對(duì)照組相比，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性有明顯的抑制作用（**P=0.02），作用效果呈藥物濃度依賴(lài)性。不同濃度二甲雙胍作用與MDA-MB-231細(xì)胞24h后，平均OD值逐漸降低。
　　2.辛伐他汀對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生物活性的影響
　　MTT分析結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的辛伐他汀作用于MDA-MB-231細(xì)胞24h后，與溶劑對(duì)照組相比，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性有明顯的抑制作用（*P=0.01），作用

5、效果呈藥物濃度依賴(lài)性。不同濃度辛伐他汀作用與MDA-MB-231細(xì)胞24h后，平均OD值逐漸降低。
　　3.二甲雙胍聯(lián)合辛伐他汀對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生物活性的影響
　　MTT分析結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度二甲雙胍聯(lián)合辛伐他汀作用于MDA-MB-231細(xì)胞24h后，與溶劑對(duì)照組、單藥相比，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性有非常明顯的抑制作用（***P=0.002），作用效果呈藥物濃度依賴(lài)性。
　　4.二甲雙胍、辛伐他汀

6、及二甲雙胍聯(lián)合辛伐他汀對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響二甲雙胍、辛伐他汀及二甲雙胍聯(lián)合辛伐他汀分別可以誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，使部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，連接松解，胞漿致密，細(xì)胞器退變，形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞核固縮、空泡樣變性、核碎裂等凋亡的形態(tài)學(xué)變化。給予二甲雙胍、辛伐他汀及二甲雙胍聯(lián)合辛伐他汀抑制細(xì)胞活性的最適濃度可以清晰的看到凋亡細(xì)胞的比例也在逐漸增加，凋亡細(xì)胞有顯著差異。
　　5.二甲雙胍聯(lián)合辛伐他汀對(duì)MDA-MB-231

7、細(xì)胞周期分布的影響
　　給予二甲雙胍、辛伐他汀及二甲雙胍聯(lián)合辛伐他汀抑制細(xì)胞活性的最大濃度，可以清晰的看到MDA-MB-231細(xì)胞DNA合成的S期細(xì)胞比例下降(P＜0.05)，而相對(duì)靜止階段的G0/G1期細(xì)胞比例卻明顯上升(P=0.02)。提示二甲雙胍、辛伐他汀及二甲雙胍聯(lián)合辛伐他汀可抑制MDA-MB-231細(xì)胞由G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化，且提示我們細(xì)胞的增殖率逐漸下降。
　　6.Western blot檢測(cè)結(jié)果
　　

8、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB、CyclinD1表達(dá)的變化，結(jié)果顯示在沒(méi)有經(jīng)過(guò)藥物處理的空白對(duì)照組，NF-κB、CyclinD1蛋白表達(dá)在最高，明顯高于二甲雙胍、辛伐他汀單藥組及聯(lián)合用藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且二甲雙胍組、辛伐他汀組中NF-κB、CyclinD1的表達(dá)高于二甲雙胍聯(lián)合辛伐他汀組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但是二甲雙胍組與辛伐他汀組兩者之間NF-κ