早期上皮細(xì)胞分化相關(guān)蛋白在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖中的功能研究.pdf

1、目的：成熟RPE細(xì)胞在體內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)且與神經(jīng)視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。RPE的增殖穩(wěn)態(tài)受到破壞會(huì)引起一系列視網(wǎng)膜病變。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)了一種早期上皮細(xì)胞分化相關(guān)蛋白（EEDA)在體外對(duì)RPE細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，但其在體的表達(dá)與生理功能尚不清楚。因此，本論文研究旨在探究這種新的功能基因在體內(nèi)是否具有抑制RPE細(xì)胞增殖的功能，并解析其作用機(jī)制。
　　方法：利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)C57BL/6J小鼠進(jìn)行基因敲

2、除；通過(guò)視網(wǎng)膜下腔注射0.25％透明質(zhì)酸鈉，制造視網(wǎng)膜脫離模型；利用H E染色在體式顯微鏡下觀察Eeda基因敲除小鼠生理狀態(tài)和視網(wǎng)膜脫離情況下RPE的形態(tài)改變；利用RT-PCRd Western blot和免疫熒光染色等技術(shù)檢測(cè)基因敲除小鼠和R P E細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：Eeda基因敲除小鼠在胚胎11.5天 RPE細(xì)胞Ki67陽(yáng)性率較高。成年期Eeda基因敲除小鼠出現(xiàn)了多層排列的RPE結(jié)構(gòu)。Eeda基因敲除

3、小鼠在視網(wǎng)膜脫離狀態(tài)下更容易被激活而進(jìn)入增殖狀態(tài)。對(duì)于作用機(jī)制的研究，我們發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá) EEDA的RPE細(xì)胞中，CDKN1A的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)CDKN1A下游的細(xì)胞周期相關(guān)基因p107、E2F1和 p-RB表達(dá)下調(diào)。而在過(guò)表達(dá)EEDA的RPE細(xì)胞中干擾 CDKN1A可以部分挽救RPE細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論：EEDA作為一種新的細(xì)胞增殖抑制基因，可以在體內(nèi)抑制RPE細(xì)胞的增殖。CDKN1A部分介導(dǎo)EEDA對(duì) RPE的增殖調(diào)控。 EED