精索靜脈曲張不育患者精漿外泌體蛋白質組學的初步研究.pdf

1、目的:
　　精索靜脈曲張已成為男性不育的主要原因之一，但其致男性不育的機制尚未闡明。建立正常人精漿外泌體蛋白譜為研究精索靜脈曲張不育患者精漿外泌體比較蛋白組學研究提供參考，初步描繪精漿外泌體相關蛋白在精索靜脈曲張致男性不育的潛在分子功能作用，發(fā)現潛在的精漿外泌體生物標志物，并進一步構建精索靜脈曲張大鼠模型以期為研究精索靜脈曲張精漿外泌體差異蛋白致男性不育的相關分子機制奠定基礎。
　　方法:
　　1.在南方醫(yī)院檢驗中心收

2、集正常志愿者精液標本18例，分別對12例精液標本采用超高速差速離心和6例精液標本采用PEG6000富集方法提取精漿外泌體，免疫印跡驗證外泌體蛋白標志物，納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)分析其粒徑大小，透射電鏡(TEM)觀察其形態(tài);
　　2.對12例超高速差速離心提取的精漿外泌體后進行精漿外泌體蛋白質譜分析，并用免疫印跡方法驗證其鑒定蛋白的可靠性;
　　3.另外選取6例精索靜脈曲張不育患者和6例正常生育志愿者精液樣本為研究對象，基

3、于TMT定量蛋白質組學技術分析其精漿外泌體差異蛋白表達譜，生物信息學基因本體(GO)分析差異蛋白的細胞定位，生物學過程，分子功能;
　　4.采用左側腎靜脈半縮窄法結合完全結扎精索靜脈各屬支構建精索靜脈曲張大鼠模型，與傳統(tǒng)方法對比，探討銀夾新方法的可行性。
　　結果:
　　1.采用超高速差速離心和PEG6000富集方法的提取物均陽性表達外泌體標志蛋白CD63，ALIX，TSG101等，TEM結果顯示其呈類圓形、橢圓形囊泡

4、形態(tài)，內含電子致密物，NTA分析顯示其粒徑大小均在30-150nm;
　　2.正常人精漿外泌體蛋白譜總共鑒定了1474個蛋白，生理狀態(tài)下這些蛋白主要參與蛋白代謝、能量途徑、蛋白代謝、細胞生長/維持和轉運等生物學過程，并選取其中PHGDH，LGALS3BP，SEMG1，ACTB，ALIX，GAPDH蛋白驗證其可靠性，結果與質譜數據相一致;
　　3.精索靜脈曲張精漿外泌體差異蛋白表達譜總共鑒定了1457個蛋白，其中定量蛋白數為1

5、331個。與正常生育組相比，發(fā)現了精索靜脈曲張不育患者精漿外泌體差異蛋白175個，其中上調76個蛋白，下調99個蛋白。GO分析表明這些差異蛋白主要參與的“細胞生長/維持”、“能量途徑”、“代謝”、“轉運”等生物學過程失調，這與精索靜脈曲張致男性不育密切相關;
　　4.與假手術組相比，傳統(tǒng)組和銀夾組在手術8周后，其左側精索靜脈直徑均大于1mm，左側腎臟未見病理學改變，顯示模型成功。其中，傳統(tǒng)組中出現左腎靜脈撕破出血及左腎積水等并發(fā)癥

6、導致造模失敗3只，銀夾組銀夾滑脫1只，傳統(tǒng)組和銀夾組造模成功率分別為75％和87.5％。
　　結論:
　　1.PEG6000富集方法可作為提取和鑒定精漿外泌體的有效方法;
　　2.建立了正常人精漿外泌體蛋白表達譜，為男性生殖系統(tǒng)疾病等比較蛋白組學研究提供了參考基礎;
　　3.初步描繪了精索靜脈曲張不育患者精漿外泌體蛋白表達譜，其差異蛋白主要表現為“細胞生長/維持”、“能量途徑”、“代謝”、“轉運”等生物學過程失調