當(dāng)歸多糖對(duì)CIK細(xì)胞生物學(xué)特性、殺傷活性的影響及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)研究主要探討當(dāng)歸多糖（Angelica sinensis polysaccharide, ASP）在體外對(duì)人外周血來源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷（cytokine induced killer, CIK）細(xì)胞在增殖能力、免疫表型、所分泌的細(xì)胞因子及其對(duì)K562細(xì)胞殺傷活性等方面的影響，并初步探討其可能的機(jī)制。
　　方法：采集健康志愿者外周血，用密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood monon

2、uclear cell，PBMC)，第0 d加入IFN-γ(1000 IU/ml)，24h后再加入IL-2(1000 IU/ml)、抗CD3單抗(50 ng/ml)繼續(xù)培養(yǎng)，此后每隔3d根據(jù)添加不同濃度的ASP分為5組：A組（不加ASP）、B～E組（分別加ASP12.5、25、50、100μg/ml）。各組均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞形態(tài)變化，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況適時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)不同時(shí)間各組CI

3、K細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目，計(jì)算增殖倍數(shù)，并繪制細(xì)胞增殖曲線，評(píng)估細(xì)胞增值情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組CIK細(xì)胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+細(xì)胞的百分比；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)各組CIK細(xì)胞細(xì)胞上清液中IL-2、IFN-γ及TNF-α的表達(dá)；CCK8法檢測(cè)各組CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性；AnnexinV-FITC/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)第13 d CIK細(xì)胞的凋亡率；最后檢測(cè)CIK細(xì)胞在培養(yǎng)至13

4、d的細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果：PBMCs體外經(jīng)多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)后得到大量擴(kuò)增的CIK細(xì)胞。不同檢測(cè)點(diǎn)各組細(xì)胞活率都保持在90%以上；其中培養(yǎng)第16天后E組（100μg ASP組）CIK細(xì)胞的增殖倍數(shù)為（142.46±9.45）倍，明顯高于對(duì)照組 CIK細(xì)胞（109.53±8.27）倍（P<0.05），差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組CIK細(xì)胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞亞群的比例在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均無明顯差異（P>0.05

5、），而D組、E組CIK細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞亞群比例在培養(yǎng)第16 d時(shí)分別為（26.65±3.71）%、（28.36±4.28）%與對(duì)照組（20.75±3.56）%相比存在差異（P<0.05）；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組CIK細(xì)胞上清液中 TNF-α、IFN-γ的表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)，在細(xì)胞因子 TNF-α的表達(dá)方面，培養(yǎng)第16天的CIK細(xì)胞中只有高濃度的ASP組（E組）TNF-α的含量較高，與對(duì)照組相比（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、意義，而其余各組表達(dá)的TNF-α含量雖較對(duì)照組高，但與對(duì)照組相比無明顯差異。中、高濃度ASP組，即D組、E組CIK細(xì)胞所分泌的IFN-γ、IL-2明顯較對(duì)照組高（P<0.05），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)第16d的各組CIK細(xì)胞隨著效靶比的增高，其殺傷活性依次增強(qiáng)，在效靶比為40:1、20:1、10:1時(shí)，E組CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性分別為（84.19±5.88）%、（76.69±6.54）%、（72.32±9.22）%，而對(duì)

7、照組的殺傷活性則分別為（68.05±5.95）%、（64.55±9.44）%、（61.45±8.22）%，相比較高濃度ASP組CIK的殺傷活性更強(qiáng)（P<0.05）；經(jīng)100μg/ml ASP誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞在不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)（第7、10、13天） CD25的表達(dá)率高，分別為（40.56±4.47）%、（55.34±4.71）%、（20.25±4.79）%，而對(duì)照組則為（34.17±3.86）%、（42.24±4.58）%、(14.98

8、±3.67)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且其下降趨勢(shì)明顯較對(duì)照組平緩。用100μg/ml ASP誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞在第13 d的細(xì)胞早期凋亡率為（8.38±0.89）%，明顯低于對(duì)照組（14.31±1.76）%，P<0.05，差異存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同為培養(yǎng)第13天的 CIK細(xì)胞，用100μg/ml ASP誘導(dǎo)培養(yǎng)的 CIK細(xì)胞處于 G1期的細(xì)胞百分比為（58.42±3.73）%，低于對(duì)照組（70.13±4.56）%，差異明

9、顯（P<0.05）；而處于S期的細(xì)胞百分比為（29.21±5.64）%，較對(duì)照組（16.83±3.63）%明顯增高，對(duì)比而言差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，中、高濃度的ASP對(duì)CIK細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用；中、高濃度的ASP能夠促進(jìn)CIK細(xì)胞上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子的表達(dá)水平；此外ASP能夠增加CIK細(xì)胞中的主要效應(yīng)細(xì)胞CD3+CD56+細(xì)胞亞群的比例，但對(duì)CD3+C