DHEA對原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其調(diào)節(jié)睪酮合成機(jī)制的研究.pdf

1、脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）作為膽固醇代謝途徑中的重要中間產(chǎn)物，是機(jī)體中各種類固醇激素合成的重要前體。已有研究表明，DHEA在調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、骨質(zhì)代謝、脂肪代謝等方面都發(fā)揮著重要作用。目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，DHEA主要是在外周靶組織/靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)化為睪酮或雌二醇而發(fā)揮其特有的生物學(xué)功能。睪丸間質(zhì)細(xì)胞分布于睪丸曲精小管間的疏松結(jié)締組織，其主要功能是合成和分泌睪酮，血漿睪酮的95％由睪丸間質(zhì)

2、細(xì)胞分泌。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，外源性添加DHEA可促進(jìn)不同生理期實(shí)驗(yàn)大鼠血清中睪酮和雌二醇的分泌;在TM-3細(xì)胞（小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系）上證實(shí)，DHEA處理可顯著抑制TM-3細(xì)胞的增殖，但卻能夠顯著增強(qiáng)TM-3細(xì)胞線粒體的功能;同時(shí)發(fā)現(xiàn)DHEA在TM-3細(xì)胞內(nèi)主要向睪酮和雌二醇進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但其具體機(jī)制還不是很清楚。因此，本試驗(yàn)在分離、純化和鑒定原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)之上，探討DHEA對原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、線粒體膜電

3、位等生物學(xué)特性的影響;在證實(shí)DHEA影響原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮的基礎(chǔ)之上，重點(diǎn)從蛋白水平上檢測DHEA對類固醇激素合成過程中代謝關(guān)鍵酶表達(dá)的影響，繼而探討MAPK-ERK信號通路以及核轉(zhuǎn)錄因子CREB在調(diào)節(jié)原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮中的作用。研究旨在揭示DHEA對特定靶細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響，并從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度深入闡明其調(diào)節(jié)靶細(xì)胞合成類固醇激素的作用機(jī)制，以期為深入闡明DHEA的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

4、1.DHEA對原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖特性的影響
　　本試驗(yàn)以原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞為研究對象，探討DHEA對原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖以及細(xì)胞周期的影響。以含DHEA終濃度分別為0μmol/L、1μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h后，分別采用倒置相差顯微鏡觀察和EdU法檢測DHEA對細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度的DHEA處理6h、12h、24h和48h后，其對原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞周期的

5、影響;Real-timePCR檢測DHEA處理細(xì)胞24h后，細(xì)胞周期相關(guān)因子CyclinA、CDK2和CyclinBmRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，倒置相差顯微鏡下可觀察到DHEA具有明顯抑制細(xì)胞增殖的作用;EdU法檢測進(jìn)一步證實(shí)，50μmol/L和100μmol/LDHEA處理能夠抑制細(xì)胞增殖。與對照組相比，100μmol/LDHEA處理12h-48h，可顯著升高原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中S期細(xì)胞的比例、降低G2/M期細(xì)胞比例（P＜0.

6、01）;50μmol/LDHEA處理48h，可顯著升高S期細(xì)胞的比例，降低G2/M期細(xì)胞比例(P＜0.01)。與對照組相比，100μmol/LDHEA處理可顯著降低原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中CyclinA和CDK2mRNA的表達(dá)水平(P＜0.05)，但不同濃度的DHEA處理對CyclinBmRNA的表達(dá)均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著影響(P＞0.05)。提示，DHEA處理可顯著抑制原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖，其主要機(jī)制是DHEA可顯著抑制細(xì)胞周期相關(guān)

7、因子CyclinA和CDK2mRNA的表達(dá)水平，致使原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞滯留于S期，從而抑制細(xì)胞的增殖。
　　2.DHEA對原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體功能的影響
　　本試驗(yàn)以原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞為研究對象，探討DHEA對原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響。用不同濃度DHEA處理原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞后，分別采用MTT法檢測細(xì)胞活力、透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)及數(shù)目、流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位(△Ψm)、試劑盒法測定琥珀

8、酸脫氫酶(SDH)活性變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞24h-48h，不同濃度的DHEA處理均可極顯著提高細(xì)胞的活力(P＜0.01)。1μmol/L、50μmol/L和100μmol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞48h，細(xì)胞線粒體形態(tài)和數(shù)目與對照組相比均無顯著性變化（P＞0.05）。與對照組相

9、比，不同濃度的DHEA處理均可降低原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體的膜電位;其中100μmol/LDHEA處理可極顯著降低細(xì)胞線粒體膜電位(P＜0.01)。1μmol/LDHEA處理對胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶(SDH)活性并無顯著影響（P＞0.05），但50μmol/L和100μmol/LDHEA處理可極顯著提高胞內(nèi)SDH的活性（P＜0.01）。結(jié)果提示，DHEA處理可降低原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體的膜電位而使其通透性增加，同時(shí)其可通過提高SDH的活

10、性而增強(qiáng)自身氧化代謝水平，從而顯著提高原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的活力。
　　3.DHEA對原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成及關(guān)鍵酶表達(dá)的影響
　　本試驗(yàn)以原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞為研究對象，探討外源性DHEA處理對原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的合成及其合成途徑中關(guān)鍵酶表達(dá)的影響。以含DHEA終濃度分別為0μmol/L、1μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的培養(yǎng)液孵育大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞24h，以放射免疫分析法檢測睪酮含量，以Re

11、al-timePCR法檢測3β-羥基固醇脫氫酶(3β-HSD)、17β-羥基固醇脫氫酶(17β-HSD)mRNA表達(dá)水平的變化;繼而以100μmol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞0h、3h、12h、24h和48h，以Westernblot法檢測3β-HSD、17β-HSD和Aromatase蛋白表達(dá)的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，DHEA能夠顯著促進(jìn)原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的合成，且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。50μmol/LDHEA處理可顯著提高

12、3β-HSDmRNA的表達(dá)水平，100μmol/LDHEA處理則可極顯著提高3β-HSDmRNA的表達(dá)水平(P＜0.01);同時(shí)，100μmol/LDHEA能夠顯著提高17β-HSDmRNA表達(dá)水平(P＜0.05)。Westernblot分析結(jié)果表明，與0h時(shí)相比較，100μmol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞12h-48h可顯著升高3β-HSD蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)，100μmol/LDHEA處理48h能顯著降低芳香化酶的

13、蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)，但DHEA處理不同時(shí)間對17β-HSD蛋白表達(dá)水平并無顯著性變化（P＞0.05）;與同時(shí)間點(diǎn)的對照組相比，100μmol/LDHEA處理細(xì)胞24h-48h可顯著提高3β-HSD和17β-HSD蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），而100μmol/LDHEA處理細(xì)胞24h-48h則可顯著降低Aromatase蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)。以上結(jié)果提示，DHEA處理可顯著上調(diào)原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中3β-HSD和17β

14、-HSD的mRNA和蛋白表達(dá)、下調(diào)Aromatase蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中睪酮的合成。
　　4.DHEA調(diào)節(jié)原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成相關(guān)信號通路的研究
　　本試驗(yàn)以原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞為研究對象，進(jìn)一步探討DHEA對原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成相關(guān)信號通路的影響。結(jié)果顯示，不同濃度的DHEA處理，原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2蛋白水平并未呈現(xiàn)明顯變化(P＞0.05)，但50μmol/L和100μmo

15、l/LDHEA處理可極顯著提高p-ERK1/2蛋白水平(P＜0.01)。100mol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞不同時(shí)間后，ERK1/2蛋白水平并未呈現(xiàn)明顯變化(P＞0.05);100μmol/LDHEA處理細(xì)胞30min和120min，可以極顯著提高p-ERK1/2蛋白水平（P＜0.01）;加入p-ERK1/2的抑制劑U0126處理后，DHEA對p-ERK1/2的這種促進(jìn)作用可完全被逆轉(zhuǎn)。無論有、無抑制劑存在的條件下，1μmo

16、l/L、50μmol/L和100μmol/LDHEA處理均可顯著提高原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的含量(P＜0.01)，且均呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng);同一劑量的DHEA處理?xiàng)l件下，抑制劑處理組睪酮的含量與無抑制處理組相比均明顯降低，且50μmol/L和100μmol/LDHEA處理時(shí)呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。與對照組相比，100μmol/LDHEA處理可顯著提高原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD蛋白和17β-HSD蛋白的表達(dá)水平(P＜0.05

17、)，抑制劑U0126預(yù)處理可顯著逆轉(zhuǎn)DHEA對睪丸間質(zhì)細(xì)胞3β-HSD和17β-HSD蛋白表達(dá)水平的影響(P＜0.05);100μmol/LDHEA處理可極顯著降低原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Aromatase蛋白的表達(dá)水平(P＜0.01)，但抑制劑U0126預(yù)處理并不能消除DHEA對Aromatase蛋白表達(dá)水平的抑制效應(yīng)。100μmol/LDHEA處理原代大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞30min，CREB蛋白水平并未呈現(xiàn)明顯變化（P＞0.05）;但50μ