負(fù)性協(xié)同刺激分子B7-H4在C3H10T1-2移植治療EAE中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討靶向干擾B7-H4分子前后C3H10T1/2（以下簡(jiǎn)稱C3H10）細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞亞群的影響，并觀察C3H10細(xì)胞的生存、增殖、遷移等生物學(xué)行為的改變；進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討B(tài)7-H4在C3H10細(xì)胞移植治療小鼠EAE模型中體內(nèi)效應(yīng)的機(jī)制。
　　方法：
　　1、用慢病毒將B7-H4靶向shRNA轉(zhuǎn)染至C3H10細(xì)胞構(gòu)建小鼠B7-H4靶向shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的C3H10細(xì)胞(C3H10-B7-H4細(xì)胞)，應(yīng)用K

2、i-67檢測(cè)靶向干擾B7-H4分子前后C3H10細(xì)胞增殖情況；用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長(zhǎng)曲線的變化，觀察細(xì)胞增殖能力的改變；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)B7-H4對(duì)C3H10細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR4的表達(dá)的影響，用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察C3H10細(xì)胞遷移能力的改變；將轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞分別與小鼠脾臟淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，用ELISA檢測(cè)其對(duì)T細(xì)胞亞群的影響。
　　2、利用MOG35-55和完全弗氏佐劑制備小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型，將n=50

3、只小鼠分為正常對(duì)照組（n=10）、EAE組（n=10）、C3H10組（移植C3H10細(xì)胞）（n=10）、C3H10-NC組（移植shRNA對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的C3H10細(xì)胞）（n=10）、C3H10-B7-H4組（移植C3H10-B7-H4細(xì)胞）（n=10），之后每日對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，在免疫后第6天，按1×106/只細(xì)胞數(shù)量移植入分小鼠體內(nèi)；在小鼠發(fā)病的急性期及慢性加重期，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠外周血細(xì)胞上B7-H4的表達(dá)變化

4、；用ELISA法檢測(cè)外周血可溶性B7-H4（sB7-H4）、IL-2、IL-17、IFN-γ、IL-4的表達(dá)變化；收集小鼠脾臟組織，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組脾臟細(xì)胞上B7-H4的表達(dá)變化；結(jié)合神經(jīng)功能評(píng)分觀察不同干預(yù)方式對(duì)EAE損傷組織結(jié)構(gòu)和功能的影響，明確B7-H4分子在C3H10移植治療EAE體內(nèi)效應(yīng)的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、B7-H4靶向shRNA轉(zhuǎn)染C3H10可抑制其B7-H4的表達(dá)；下調(diào)表達(dá)B7-H4后C3H10細(xì)胞

5、內(nèi)的Ki-67表達(dá)減少，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間延長(zhǎng)，增殖能力減弱；下調(diào)表達(dá)B7-H4后C3H10細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR4表達(dá)減少，劃痕愈合減慢，遷移能力減弱；下調(diào)表達(dá)B7-H4的C3H10細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞的分泌B7-H4、IL-2、IL-17、IL-4、IFN-γ的抑制作用減弱。
　　2、正常對(duì)照組小鼠未見發(fā)病，EAE組小鼠發(fā)病時(shí)間較其他組早，并且神經(jīng)功能評(píng)分高；C3H10-B7-H4組發(fā)病時(shí)間及神經(jīng)功能評(píng)分均介于C3H10組及

6、EAE組之間；EAE組小鼠外周血及脾臟中CD19+B7-H4+B細(xì)胞數(shù)量均較正常組增加，C3H10-B7-H4組介于C3H10組及EAE組之間；EAE組小鼠血漿中可溶性B7-H4表達(dá)較正常組低，IL-4在這五組小鼠體內(nèi)表達(dá)的差異不大；IL-2、IL-17、IFN-γ的表達(dá)在EAE組小鼠較正常組小鼠明顯升高，其中C3H10細(xì)胞治療后可以抑制IL-2、IL-17的表達(dá)，下調(diào)表達(dá)B7-H4的C3H10細(xì)胞治療后對(duì)這些分子表達(dá)的抑制作用減弱。<

7、br>　　結(jié)論：
　　1、B7-H4分子參與了C3H10細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖、活化的抑制過(guò)程，這一過(guò)程可能是通過(guò)對(duì)可溶性分子B7-H4、IL-2、IL-17、IFN-γ等相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響起作用。
　　2、B7-H4分子在C3H10移植治療小鼠EAE模型的病程中發(fā)揮了重要作用，并且可能是通過(guò)影響C3H10細(xì)胞的存活、增殖、遷移等生物學(xué)行為發(fā)揮作用。
　　3、B7-H4介導(dǎo)了C3H10移植治療EAE的免疫調(diào)節(jié)，這一過(guò)程可