微納形貌鉭及鉭-羥基磷灰石涂層對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.pdf

1、隨著種植牙技術(shù)的發(fā)展和普及，越來越多的人將種植牙作為缺牙修復(fù)的首要選擇。種植體與周圍骨之間快速、穩(wěn)定的骨結(jié)合是種植牙成功的關(guān)鍵，也是種植體表面改性的主要目標(biāo)。
　　種植體的表面形貌和化學(xué)成分是影響骨整合能力的重要因素。涂層修飾能夠有效地改善種植體表面理化性質(zhì)，形成有利于骨整合的材料/細(xì)胞界面，從而提高種植體的骨整合性能。羥基磷灰石(HA)是常見的種植體表面涂層材料，然而良好的生物活性并不能彌補(bǔ)其脆性大及界面結(jié)合強(qiáng)度低等弱點(diǎn)。在羥基

2、磷灰石中摻入添加劑制備復(fù)合涂層是提高其力學(xué)性能的重要發(fā)展方向。多孔鉭憑借其優(yōu)異的生物學(xué)性能，被視作新一代的金屬植入材料，已在關(guān)節(jié)外科領(lǐng)域取得了顯著的臨床療效。近年來，鉭作為表面涂層材料，引起了人們的廣泛興趣。目前，通過對(duì)生物材料的微觀結(jié)構(gòu)和性能設(shè)計(jì)來調(diào)控干細(xì)胞的生物學(xué)行為是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。從仿生學(xué)角度，微納結(jié)構(gòu)能更好地模擬細(xì)胞生存的微環(huán)境，有利于骨組織的修復(fù)再生。
　　本研究中我們采用大氣等離子噴涂技術(shù)，在純鈦表面制備微納形貌的

3、鉭以及鉭/羥基磷灰石復(fù)合涂層并檢測(cè)其表面理化特性。以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為模型，體外研究鉭以及鉭/羥基磷灰石復(fù)合涂層對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附、增殖以及成骨分化等生物學(xué)行為的影響，為進(jìn)一步動(dòng)物體內(nèi)研究涂層種植體骨結(jié)合性能奠定基礎(chǔ)，為種植體表面改性的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供新思路以及新型種植體的探索提供理論依據(jù)。
　　第一部分微納形貌鉭涂層對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)活性的影響
　　目的:研究鈦表面微納形貌鉭涂層的表面理化特性以及蛋白吸附性能，

4、探討微納形貌鉭涂層對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附、增殖和成骨分化等生物學(xué)行為的影響，以評(píng)價(jià)其細(xì)胞相容性，并為種植體表面改性的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)。
　　方法:
　　1、在本課題組前期的研究基礎(chǔ)上，利用大氣等離子噴涂技術(shù)在純鈦表面制備微納形貌的鉭涂層。經(jīng)過參數(shù)優(yōu)化，電弧功率設(shè)定為25KW，噴射距離為130mm。
　　2、利用掃描電子顯微鏡觀察試樣的表面形貌，衍射儀分析其物相組成，輪廓儀檢測(cè)試樣的粗糙度并測(cè)定表面接觸角;采用垂直拉

5、伸法測(cè)定涂層試件的結(jié)合強(qiáng)度;
　　3、采用MicroBCA法對(duì)試件表面吸附蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。
　　4、通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離原代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、培養(yǎng)擴(kuò)增并進(jìn)行流式分子表型鑒定以及成脂、成骨分化鑒定。
　　5、將BMSCs與材料共培養(yǎng)，通過細(xì)胞核染色、計(jì)數(shù)材料表面粘附細(xì)胞，采用掃描顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架，MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。
　　6、對(duì)材料表面BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，通過堿性磷

6、酸酶活、茜素紅染色以及細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原、骨鈣素含量考察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力。
　　7、采用Rea-time PCR方法檢測(cè)材料表面細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因RuNX2、ALP、BMP-2和OPN的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、純鈦表面的鉭涂層形成淺碟狀微米坑和納米孔隙的微納多級(jí)復(fù)合結(jié)構(gòu)。
　　2、對(duì)比純鈦和鈦涂層，微納結(jié)構(gòu)鉭涂層的粗糙度較高，而表面接觸角較小，并與基體具有較高的界面結(jié)合強(qiáng)度。
　　3、

7、微納結(jié)構(gòu)的鉭涂層吸附蛋白能力優(yōu)于純鈦和鈦涂層。
　　4、骨髓間充干細(xì)胞在鉭涂層表面粘附的數(shù)量明顯較多，伸展良好，而且細(xì)胞骨架排列有序。培養(yǎng)4天后，微納形貌涂層表面細(xì)胞的增殖活力開始高于純鈦。
　　5、相對(duì)于純鈦，微納結(jié)構(gòu)涂層顯著促進(jìn)了BMSCs的堿性磷酸酶的活性、Ⅰ型膠原和骨鈣素的分泌和細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，并且上調(diào)了成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)，鉭涂層更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、采用等離子噴涂技術(shù)在

8、純鈦表面形成的微納形貌鉭涂層致密均勻、結(jié)合力強(qiáng)且具有良好的親水性和蛋白吸附能力。
　　2、微納米形貌鉭涂層具有較好的細(xì)胞相容性，能夠促進(jìn)BMSCs的粘附、增值和成骨分化能力。
　　第二部分微納形貌鉭/羥基磷灰石復(fù)合涂層對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)活性的影響
　　目的:采用大氣等離子噴涂技術(shù)，在純鈦表面制備微納形貌的鉭/羥基磷灰石復(fù)合涂層并研究其表面特性，考察微納形貌鉭/羥基磷灰石復(fù)合涂層對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，

9、以評(píng)價(jià)其生物相容性，為開發(fā)新型人工牙種植體提供依據(jù)，并篩選細(xì)胞相容性最佳的復(fù)合涂層。
　　方法:
　　1、采用大氣等離子噴涂技術(shù)，優(yōu)化參數(shù)，在純鈦表面制備微納形貌鉭/羥基磷灰石復(fù)合涂層。
　　2、通過掃描電子顯微鏡、X射線衍射儀、接觸角測(cè)試儀和粗糙度儀分別檢測(cè)涂層試樣的微觀形貌、物相組成、濕潤性和粗糙度，以表征其理化特性。
　　3、利用萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)定涂層的結(jié)合強(qiáng)度，并用BCA法定量分析涂層試樣吸附蛋白能力。<

10、br>　　4、將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與不同質(zhì)量比例的微納形貌鉭/羥基磷灰石復(fù)合涂層共培養(yǎng)，采用掃描電鏡和熒光顯微鏡觀察材料表面的細(xì)胞形態(tài)并對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，MTS法檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　5、對(duì)材料表面的BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，采用全自動(dòng)生化儀定量檢測(cè)細(xì)胞分泌鈣、堿性磷酸酶和骨鈣素的能力，采用茜素紅染色法半定量細(xì)胞外基質(zhì)礦化水平，通過實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、純鈦表面形成微納形貌鉭/羥基磷

11、灰石復(fù)合涂層，且均致密均勻，與基體結(jié)合良好。
　　2、隨著鉭質(zhì)量比的增加，涂層的粗糙度呈增加趨勢(shì)，親水性逐漸降低，結(jié)合強(qiáng)度也逐漸增大，均介于鉭涂層和羥基磷灰石涂層之間，且具有良好的親水性和結(jié)合強(qiáng)度。
　　3、復(fù)合涂層蛋白吸附能力強(qiáng)于羥基磷灰石涂層和純鈦，不同質(zhì)量比例的復(fù)合涂層組間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在微納形貌鉭/羥基磷灰石復(fù)合涂層表面粘附的數(shù)量明顯較多，且充分伸展良好。培養(yǎng)3天后，微納形貌復(fù)合涂層

12、表面細(xì)胞的增殖活力開始高于純鈦。
　　5、相對(duì)于純鈦，微納形貌涂層顯著促進(jìn)了BMSCs的堿性磷酸酶活性、Ca和骨鈣素分泌以及細(xì)胞外基質(zhì)礦化，并且上調(diào)了成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)水平，其中HA1Ta9和HA2Ta8涂層與羥基磷灰石涂層也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6、鉭/羥基磷灰石復(fù)合涂層促進(jìn)BMSCs的成骨分化能力呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，即HA1Ta9＞HA2Ta8＞HA3 Ta7＞ HA4Ta6。
　　結(jié)論:
　　1、微納形貌