骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合珊瑚羥基磷灰石修復(fù)兔顱骨缺損的研究.pdf

1、目的 大面積顱骨缺損的修復(fù)一直是神經(jīng)外科臨床工作的一個(gè)重點(diǎn)，其關(guān)鍵問題是修復(fù)材料的來源，而傳統(tǒng)的修復(fù)材料存在各種各異的缺點(diǎn)。隨著組織工程的飛速發(fā)展，體外預(yù)構(gòu)的組織工程骨有可能為顱骨缺損提供較理想的修復(fù)方式。本試驗(yàn)探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的生物學(xué)特性和成骨分化能力，研究以BMSCs為種子細(xì)胞、10％珊瑚羥基磷灰石(CHA)為細(xì)胞外基質(zhì)材料構(gòu)建的組織工程骨的成骨能力。 一、兔BMSCs的生物學(xué)特性和向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能

2、力 方法 以密度梯度離心法(1.073g/ml的淋巴細(xì)胞分離液)和貼壁篩選法獲得兔BMSCs，原代培養(yǎng)后1∶3傳代，分別接種于普通DMEM培養(yǎng)基(A組)和添加成骨誘導(dǎo)劑(含10-9mol/L地塞米松(DEX)、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和50mg/LL-抗壞血酸(L-ASC))的DMEM培養(yǎng)基(B組)。定期更換培養(yǎng)基，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和形態(tài)變化。用MTT法分析BMSCs在兩種培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)活力。檢測(cè)兩種

3、培養(yǎng)條件下BMSCs向成骨細(xì)胞分化的指標(biāo)，包括定量法檢測(cè)第1、2、3、4周時(shí)堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)第4周時(shí)BMSCs分泌Ⅰ型膠原和四環(huán)素?zé)晒夥z測(cè)第5周時(shí)礦化結(jié)節(jié)的形成。 結(jié)果 密度梯度離心法和貼壁篩選法從骨髓中獲得可貼壁增值、呈紡錘形的BMSCs。在普通培養(yǎng)(A組)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)(B組)條件下BMSCs從第3天開始快速增值，第8天達(dá)到最高峰；在3-8天細(xì)胞數(shù)兩組間有顯著差異性。ALP定量檢測(cè)示A、B兩組B

4、MSCs在4周時(shí)表達(dá)量明顯升高，有顯著差異性。4周時(shí)Ⅰ型膠原免疫組化B組陽(yáng)性率90％，A組無陽(yáng)性細(xì)胞。5周時(shí)礦化結(jié)節(jié)四環(huán)素染色于熒光顯微鏡下可見B組礦化結(jié)節(jié)呈黃綠色，A組無礦化結(jié)節(jié)。 結(jié)論 骨髓是良好的間充質(zhì)干細(xì)胞來源，通過密度梯度離心法結(jié)合貼壁法能從兔骨髓中提取到BMSCs，經(jīng)過培養(yǎng)傳代后可獲得足量的細(xì)胞。10-9mol/LDEX、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和50mg/LL-ASC聯(lián)合誘導(dǎo)下，能夠明顯促進(jìn)BMSCs向成骨

5、方向的分化，表現(xiàn)為ALP的表達(dá)、Ⅰ型膠原的分泌和礦化結(jié)節(jié)形成，是促使BMSCs向成骨方向分化的良好的誘導(dǎo)劑。通過誘導(dǎo)BMSCs成骨分化并結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，可以初步鑒定所獲得的成纖維樣細(xì)胞符合BMSCs的特點(diǎn)。 二、兔BMSCs復(fù)合10％珊瑚羥基磷灰石修復(fù)顱骨缺損 方法 原代培養(yǎng)的兔BMSCs以1∶3傳代，接種于添加成骨誘導(dǎo)劑(10-9mol/LDEX、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和50mg/LL-ASC)的DMEM

6、培養(yǎng)基。定期更換培養(yǎng)基，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和形態(tài)變化。收集第4代經(jīng)成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞，以5×10-7/ml的密度接種于10％CHA，培養(yǎng)1，3和7天后作掃描電鏡檢查。以培養(yǎng)7天的10％CHA+BMSCs復(fù)合物植入兔顱骨直徑1.5cm缺損處為試驗(yàn)組(A組，n=8)；單純植入CHA(B組，n=4)和無任何植入物(C組，n=4)為對(duì)照組。A組于6和12周、B和C組于12周時(shí)行X線檢查；行X線后分別處死動(dòng)物，觀察修復(fù)后顱骨表面的完整

7、性、硬度、與周圍自體骨質(zhì)的結(jié)合情況等；然后取材固定、脫鈣、包埋、切片，行HE染色。 結(jié)果 BMSCs向成骨誘導(dǎo)分化后，與10％CHA復(fù)合培養(yǎng)3-7天，掃描電鏡顯示細(xì)胞能在10％CHA很好地黏附生長(zhǎng)。大體觀察可見A組6、12周時(shí)組新生骨質(zhì)地硬，與周圍自體骨結(jié)合緊密；B組12周時(shí)表面粗糙，呈顆粒狀，質(zhì)地軟，周圍包繞組織囊；C組僅有軟組織填充。X線檢查可見A組植入物與自體骨密度基本一致，兩者結(jié)合緊密；B組密度明顯降低，呈顆粒狀密度影

8、，和自體骨結(jié)合不緊密；C組僅可見軟組織密度影。HE染色示A組有大量新骨形成，新生骨之間相互結(jié)合，有血管長(zhǎng)入，未見炎細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。B組可見材料明顯降解，無新生骨。C組僅可見結(jié)締組織。 結(jié)論 10％CHA有良好的生物相容性、良好的細(xì)胞材料表面、適當(dāng)?shù)纳锝到庑院腿S立體結(jié)構(gòu)，是骨組織工程良好的細(xì)胞外基質(zhì)材料。BMSCs是骨組織工程理想的種子細(xì)胞，可在10％CHA表面緊密黏附生長(zhǎng)。以BMSCs為種子細(xì)胞，10％CHA為支架材料