BMSCs復(fù)合珊瑚羥基磷灰石修復(fù)顱骨缺損的研究.pdf

1、目的:大面積顱骨缺損的修復(fù)一直是神經(jīng)外科臨床工作的一個重點，其關(guān)鍵問題是修復(fù)材料的來源，而傳統(tǒng)的修復(fù)材料存在各種各樣的缺點。隨著組織工程的飛速發(fā)展，體外預(yù)構(gòu)的組織工程骨有可能為顱骨缺損提供較理想的修復(fù)方式。本實驗探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的生物學(xué)特性和成骨分化能力，研究以BMSCs為種子細(xì)胞、10％珊瑚羥基磷灰石(CHA)為細(xì)胞外基質(zhì)材料構(gòu)建的組織工程骨的成骨能力。 一、鼠BMCs的生物學(xué)特性和向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力

2、 方法:以貼壁篩選法獲得鼠BMSCs，原代培養(yǎng)后1：3傳代，分別接種于普通 DMEM培養(yǎng)基(A組)和添加成骨誘導(dǎo)劑(含10<'-9>mol/L地塞米松(DEX)、10mmol/L β-甘油磷酸鈉和50mg/L L-抗壞血酸(bASC))的DMEM培養(yǎng)基(B組)。定期更換培養(yǎng)基，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和形態(tài)變化。用MTT法分析BMSCs在兩種培養(yǎng)條件下的生長活力。檢測兩種培養(yǎng)條件下BMSCs向成骨細(xì)胞分化的指標(biāo)，包括定量

3、法檢測第5、10、15、20天時堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)，免疫組化法檢測第4周時BMSCs分泌I型膠原和四環(huán)素?zé)晒夥z測第5周時礦化結(jié)節(jié)的形成。 結(jié)果:貼壁篩選法從骨髓中獲得可貼壁增殖、呈紡錘形的BMSCs。在普通培養(yǎng)(A組)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)(B組)條件下BMSCs從第3天開始快速增殖，第8天達(dá)到最高峰；在3-8天細(xì)胞數(shù)兩組間有顯著差異性。ALP定量檢測示B組 BMSCs在15天時表達(dá)量明顯升高，有顯著差異性。4周時I型膠原免疫

4、組化B組陽性率90％，A組無陽性細(xì)胞。5周時礦化結(jié)節(jié)四環(huán)素染色于熒光顯微鏡下可見B組礦化結(jié)節(jié)呈黃綠色，A組無礦化結(jié)節(jié)。 結(jié)論:骨髓是良好的間充質(zhì)干細(xì)胞來源，通過貼壁法能從鼠骨髓中提取到BMSCs，經(jīng)過培養(yǎng)傳代后可獲得足量的細(xì)胞。10<'-9>mol/L DEX、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和50mg/LL-ASC聯(lián)合誘導(dǎo)下，能夠明顯促進(jìn)BMSCs向成骨方向的分化，表現(xiàn)為ALP的表達(dá)、I型膠原的分泌和礦化結(jié)節(jié)形成，是促使BMSC

5、s向成骨方向分化的良好的誘導(dǎo)劑。通過誘導(dǎo)BMSCs成骨分化并結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，可以初步鑒定所獲得的成纖維樣細(xì)胞符合BMSCs的特點。 二、鼠BMsCs復(fù)合10％珊瑚羥基磷灰石修復(fù)顱骨缺損 方法:原代培養(yǎng)的鼠BMSCs以1：3傳代，接種于添加成骨誘導(dǎo)劑(10<'-9>mol/LDEX、10mmol/L β-甘油磷酸鈉和50mg/L L-ASC)的DMEM培養(yǎng)基。定期更換培養(yǎng)基，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和形態(tài)變化

6、。收集第4代經(jīng)成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞，以5×10<'7>/ml的密度接種于10％CHA，培養(yǎng)1，3和7天后作掃描電鏡檢查。以培養(yǎng)7天的10％CHA+BMSCs復(fù)合物植入兔顱骨直徑2.5cm缺損處為實驗組(A組，n=8)；單純植入CHA(B組，n=4)和無任何植入物(C組，n=4)為對照組。A組于6和12周、B和C組于12周時行X線檢查；行X線后分別處死動物，觀察修復(fù)后顱骨表面的完整性、硬度、與周圍自體骨質(zhì)的結(jié)合情況等；然后取材固定、脫鈣、包埋、

7、切片，行HE染色。 結(jié)果:BMSCs向成骨誘導(dǎo)分化后，與10％CHA復(fù)合培養(yǎng)3-7天，掃描電鏡顯示細(xì)胞能在10％CHA很好地黏附生長。大體觀察可見A組6、12周時新生骨質(zhì)地硬，與周圍自體骨結(jié)合緊密；B組12周時表面粗糙，呈顆粒狀，質(zhì)地軟，周圍包繞軟組織囊；C組僅有軟組織填充。X線檢查可見A組植入物與自體骨密度基本一致，兩者結(jié)合緊密；B組密度明顯降低，呈顆粒狀密度影，和自體骨結(jié)合不緊密；C組僅可見軟組織密度影。HE染色示A組有大量

8、新骨形成，新生骨之間相互結(jié)合，有血管長入，未見炎細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。B組可見材料明顯降解，無新生骨。C組僅可見結(jié)締組織。 結(jié)論:10％CHA有良好的生物相容性、良好的細(xì)胞材料表面、適當(dāng)?shù)纳锝到庑院腿S立體結(jié)構(gòu)，是骨組織工程良好的細(xì)胞外基質(zhì)材料。BMSCs是骨組織工程理想的種子細(xì)胞，可在10％CHA表面緊密黏附生長。以BMSCs為種子細(xì)胞，10％CHA為支架材料構(gòu)建的組織工程骨，在兔顱骨缺損處有明顯的成骨，無明顯的免疫排斥反應(yīng)，