Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas病毒防卸功能的遺傳學(xué)分析.pdf

1、許多細(xì)菌和大多數(shù)的古菌基因組均編碼稱作CRISPR-Cas(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated)的獲得性免疫系統(tǒng)來抵御病毒或質(zhì)粒的侵害。CRISPR-Cas系統(tǒng)被分為3個(gè)主要類型，Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型，又被進(jìn)一步劃分為11個(gè)亞型。Sulfolobus islandics Rey15A編碼一個(gè)Ⅰ-A亞型(Cascade)和兩個(gè)Ⅲ-B

2、亞型（Cmr-α和Cmr-β）CRISPR-Cas干涉系統(tǒng)，本研究項(xiàng)目開始以前，這些系統(tǒng)中的cas基因的功能未被解析，而且，當(dāng)時(shí)已研究過的Cmr系統(tǒng)被證實(shí)在體外切割RNA，但它們的體內(nèi)RNA切割活性并未被證實(shí)。本研究的以S.islandicus Rey15A為研究材料，解析了Ⅰ-A亞型系統(tǒng)中每個(gè)Cas蛋白在CRISPR介導(dǎo)的DNA干涉中的功能，另外，明確地證實(shí)了Cmr系統(tǒng)的體內(nèi)RNA干涉活性。
　　為了分析S.islandicus

3、 Rey5AⅠ-A亞型系統(tǒng)中單個(gè)cas基因在入侵物免疫過程中的功能，我們構(gòu)建了S.islandicus Rey5AⅠ-A亞型系統(tǒng)中單個(gè)cas基因以及除Ⅰ-A亞型系統(tǒng)外的其它幾個(gè)cas基因座的缺失株。對(duì)每個(gè)缺失株在pre-crRNA加工及質(zhì)粒干涉方面的表型進(jìn)行分析后，結(jié)果說明，Cas7，Cas5，Cas6和Cas3為Ⅰ-A亞型系統(tǒng)介導(dǎo)的DNA干涉所必需的蛋白成分，然而，Csa5及其它幾個(gè)CRISPR-Cas系統(tǒng)均不參與此過程。Cas6被證

4、實(shí)為此菌株中唯一一個(gè)負(fù)責(zé)pre-crRNA加工的酶，同時(shí)Cas7，Cas5和Cas3也介入此過程。Cas7和Cas5分別穩(wěn)定pre-crRNA加工中間產(chǎn)物和成熟crRNA;缺少Cas3后加工中間產(chǎn)物大量積累，但其中涉及的原理目前未知。
　　S.islandicus Rey15A Cmr系統(tǒng)介導(dǎo)的的體內(nèi)RNA干涉活性的確定是通過構(gòu)建一個(gè)RNA干涉試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)的。RNA干涉試驗(yàn)的原理是在質(zhì)粒上表達(dá)一個(gè)人工CRISPR（artificia

5、l CRISPR;所得到質(zhì)粒稱為pAC質(zhì)粒），該人工CRISPR含有一個(gè)來源于β-糖苷酶編碼基因lacS的spacer，因此，從pAC上表達(dá)出來的crRNA能夠介導(dǎo)內(nèi)源CRISPR-Cmr系統(tǒng)對(duì)lacS信使RNA進(jìn)行干涉，而干涉效果可以通過檢測(cè)pAC轉(zhuǎn)化子細(xì)胞提取物中殘留的β-糖苷酶活性來進(jìn)行評(píng)估。在不同的Cmr基因座缺失株中檢測(cè)RNA干涉活性結(jié)果顯示，只有兩個(gè)Cmr基因座均缺失的突變株失去了RNA干涉能力，說明每個(gè)Cmr系統(tǒng)均參與了體

6、內(nèi)RNA干涉。在spacer的不同位點(diǎn)引入突變并用來構(gòu)建pAC質(zhì)粒，通過檢測(cè)這些突變對(duì)RNA干涉活性的影響，一個(gè)位于crRNA3'端的3nt長的序列被確定為對(duì)RNA干涉活性至關(guān)重要。對(duì)pAC轉(zhuǎn)化子中未被切割的lacS信使RNA的量用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行評(píng)估的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Cmr介導(dǎo)的體內(nèi)RNA切割活性。3'-RACE結(jié)果顯示，lacS信使RNA中的剪切位點(diǎn)被定位在S1 protospacer序列內(nèi)，結(jié)果還表明，Cmr-α利用尺標(biāo)原理在測(cè)