sTNFRⅡ-adiponectin融合蛋白改構(gòu)體的真核表達(dá)、制備及其生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、目的：
　　為了增加sTNFRⅡ-adiponectin融合蛋白多聚體的形成和分泌，對sTNFRⅡ-adiponectin基因進(jìn)行改構(gòu)。一方面是在sTNFRⅡ基因和adiponectin基因之間加入一段連接肽(linker)，即構(gòu)成sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白。另一方面是利用44kDa的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白(endoplasmic reticulum protein44，ERP44)能滯留新合成的脂聯(lián)素單體，并

2、可以在細(xì)胞內(nèi)形成三聚體、六聚體和高分子量多聚體的特點，合成后的脂聯(lián)素借助ERP44和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶1-Lα(endoplasmicoxidoreductin1 like protein，Ero1-Lα)以調(diào)節(jié)型的方式分泌到細(xì)胞外。通過這兩種方法旨在構(gòu)建一種以三聚體、六聚體和多聚體為主的新型雙功能融合蛋白，從而增加腫瘤壞死因子受體Ⅱ與TNFα的親和力;同時利用富含“GC”的真核載體快速高效表達(dá)蛋白，初步探索了無血清懸浮流加培養(yǎng)的方法，為

3、進(jìn)一步優(yōu)化快速、高效表達(dá)相關(guān)融合蛋白的大規(guī)模無血清懸浮流加培養(yǎng)工藝奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.獲取ERP44和sTNFRⅡ-linker-adiponectin基因
　　①通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，從人脂肪組織中獲得脂聯(lián)素cDNA，以該cDNA為模板，通過PCR得到ERP44基因。
　?、谝詫嶒炇冶４娴膒MH3-sTNFRⅡ-adiponectin為模板，分別擴(kuò)增基因sTNFRⅡ和adi

4、ponectin，再將連接肽(linker，ACG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGAGGC AGC GGC GGG GGC GGA TCC GGC GAA TTC)和這兩段基因進(jìn)行融合，得到sTNFRⅡ-linker-adiponectin基因。
　　2.構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adiponectin
　　通過PCR和重組PCR技術(shù)分別擴(kuò)增目的基因ERP44

5、和sTNFRⅡ-linker-adiponectin，將pCA、pMH3載體分別進(jìn)行雙酶切，再通過ClonExpress(@)Ⅱ One Step Cloning Kit(一步法無縫克隆試劑盒)進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，得到pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adiponectin質(zhì)粒。
　　3.建立ERP44高表達(dá)的sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44) CHO-S細(xì)胞株
　　先通過電轉(zhuǎn)

6、的方法，將成功構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選得到高表達(dá)sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT融合蛋白的細(xì)胞株。再通過電轉(zhuǎn)的方法，將pCA-ERP44表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入CHO-S細(xì)胞中，經(jīng)嘌呤霉素篩選得到在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定高效表達(dá)sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT融合蛋白的細(xì)胞株。通過PPARγ激活劑的作用增加sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白的多聚化和分泌，以便獲得更

7、高表達(dá)量、更高活性的融合蛋白。本文有關(guān)的sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白指的均是指在ERP44和羅格列酮作用下表達(dá)出來的融合蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT。
　　4.建立高效表達(dá)sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白的CHO-S細(xì)胞株
　　通過電轉(zhuǎn)的方法，將構(gòu)建成功的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞中，經(jīng)過G418篩選得到穩(wěn)定高效表達(dá)sTNFRⅡ-l

8、inker-adiponectin融合蛋白的細(xì)胞株。
　　5.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白的獲取
　　5.1貼壁培養(yǎng)
　?、俳?jīng)抗生素篩選（先用G418篩選，再用嘌呤霉素篩選）出的高表達(dá)細(xì)胞株于T75平皿中貼壁培養(yǎng)，通過PPARγ激活劑（羅格列酮）增加脂聯(lián)素的轉(zhuǎn)錄和蛋白的分泌，PPARγ激活后能誘導(dǎo)Ero1-Lα表達(dá)，然后Ero

9、1-Lα與ERP44結(jié)合，促使被滯留在細(xì)胞內(nèi)的高分子量脂聯(lián)素分泌到細(xì)胞外。最后通過收集細(xì)胞上清，利用鎳柱純化獲取目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)，透析過夜后用超濾管對蛋白進(jìn)行濃縮，并通過Western-blot、考馬斯亮藍(lán)染色法來鑒定目的蛋白大小。
　?、趯⒑Y選出高效表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株于T75中貼壁培養(yǎng)，收集細(xì)胞上清，利用鎳柱純化獲取目的蛋白sTNFRⅡ-linker-adiponectin

10、，透析過夜后用超濾管對目的蛋白進(jìn)行濃縮，并通過Western-blot、考馬斯亮藍(lán)染色法來鑒定目的蛋白大小。
　　5.2懸浮培養(yǎng)初探
　　將T75中貼壁培養(yǎng)的高表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株用B001培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮馴化，得到適合懸浮生長的穩(wěn)定高效表達(dá)目的蛋白的工程細(xì)胞株。
　　6.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白活性的測定
　　通過C

11、CK-8試劑盒檢測目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin中和TNF-α殺傷L929細(xì)胞的活性，比較目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)、 sTNFRⅡ-linker-adiponectin、sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT和標(biāo)準(zhǔn)品sTNFRⅡ-Fc拮抗TNFα的能力的差異。
　　結(jié)果：
　　1

12、.成功得到了ERP44和sTNFRⅡ-linker-adiponectin基因
　?、僖匀酥?lián)素的cDNA為模板進(jìn)行PCR，用1％的瓊脂糖檢測結(jié)果，成功得到與預(yù)期條帶大小一致的片段。
　?、趯CR得到的基因sTNFRⅡ、adiponectin和linker進(jìn)行重疊PCR，用1％的瓊脂糖檢測結(jié)果，成功得到與預(yù)期條帶大小一致的片段。
　　2.成功構(gòu)建質(zhì)粒了pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adip

13、onectin
　　提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切，用1％的瓊脂糖鑒定酶切結(jié)果，得到與預(yù)期大小相符的條帶，將該質(zhì)粒送測序鑒定目的基因，與NCBI上獲取的基因序列比對后完全一致，提示成功構(gòu)建pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adiponectin。
　　3.在ERP44高表達(dá)的CHO-S細(xì)胞株中成功表達(dá)出了融合蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)
　　通過電轉(zhuǎn)的方法，將pCA-E

14、RP44表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞中，經(jīng)嘌呤霉素(puromycin)篩選得到在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白的細(xì)胞株。經(jīng)PPARγ激活劑（羅格列酮）處理后，對細(xì)胞內(nèi)sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白的表達(dá)起到一定調(diào)控的作用。
　　4.成功在CHO-S細(xì)胞中表達(dá)出了sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白
　　電轉(zhuǎn)后的

15、細(xì)胞經(jīng)G418加壓篩選后，通過Dot-Blot篩選出高表達(dá)細(xì)胞株，經(jīng)過3輪抗生素篩選后，挑選表達(dá)量較高的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，得到了高效表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。
　　5.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白的純化
　　鎳柱純化時，目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponec

16、tin的咪唑洗脫濃度分別在130mM和235mM左右，純化后成功得到目的蛋白。經(jīng)過WB鑒定，目的蛋白的單體大小均在70kDa左右，并且以多聚體的形式存在為主。
　　6.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白活性的測定
　　sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白

17、均具有顯著抑制TNFα殺傷L929細(xì)胞的活性，且隨蛋白濃度的升高，抑制TNFα殺傷L929細(xì)胞越明顯。結(jié)果表明目的蛋白活性均強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)品sTNFRⅡ-Fc和實驗室保存的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT。
　　結(jié)論：
　　本實驗成功構(gòu)建了質(zhì)粒pCA-ERP44，通過PPARγ激活劑（羅格列酮）增加了脂聯(lián)素的轉(zhuǎn)錄和目的蛋白的分泌，PPARγ被激活后可以誘導(dǎo)Ero1-Lα表達(dá)，然后Ero1-Lα與ERP44結(jié)合，

18、能促使被滯留在細(xì)胞內(nèi)的高分子量脂聯(lián)素分泌到細(xì)胞外。同時在CHO-S細(xì)胞中也得到了目的蛋白表達(dá)，并篩選出了高表達(dá)目的蛋白的單克隆細(xì)胞株。收取細(xì)胞上清，經(jīng)鎳柱純化獲得具有一定體積并測得具有較好活性的融合蛋白。
　　同時本實驗成功構(gòu)建了sTNFRⅡ-linker-adiponectin真核表達(dá)載體，在CHO-S細(xì)胞中也檢測到了目的蛋白表達(dá)，并且篩選出高效穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。收取細(xì)胞上清，經(jīng)鎳柱純化后也得到了一定體積的目的蛋白并測得